精氨酸血管加压素与去甲肾上腺素联合应用时对非控制性出血性休克肝肾血流量及线粒体功能的影响

作者：李涛 刘良明 朱娱 范小青 廖自福 程凤    作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042 　　【摘要】  目的 观察精氨酸血管加压素（arginine vasopressin, AVP）与去甲肾上腺素（NE）合用提高非控制性出血性休克大鼠复苏效果的机制。方法 采用大鼠脾实质切除及脾动脉切断方法复制非控制性出血性休克模型，在止血前采用低压复苏（50mmHg，1小时）后结扎血管彻底止血，观察乳酸林格氏液（LR）、NE、AVP 0.4U/kg、AVP 0.04U/kg、AVP 0.4+NE或0.04U/kg+NE对肝、肾线粒体功能和血流量的影响。组织血流量采用激光多普勒测定，线粒体功能以呼吸控制率［即在有或无二磷酸腺苷（ADP）条件下消耗氧的比率］表示。结果 非控制性出血性休克大鼠在休克后以及低压复苏后肝、肾线粒体功能和血流量均明显降低，LR、NE、AVP 0.04或0.4U/kg复苏不能有效改善肝、肾组织线粒体功能以及肝肾组织血流量，AVP 0.4U/kg或0.04U/kg与NE合用可明显改善休克动物肝、肾组织线粒体功能和组织血流量，与LR组、NE组、AVP 0.4U/kg或0.04U/kg组相比有显著性差异（P<0.05）。结论 AVP与NE合用改善非控制性出血性休克大鼠的复苏效果与其改善休克动物重要器官线粒体功能和组织血流量有关。

　　【关键词】  出血性休克 精氨酸血管加压素 线粒体 血流量

　　精氨酸血管加压素（arginine vasopressin，AVP）在渗透压调节、心血管功能控制和保持内环境稳定中具有重要作用［1］。研究表明AVP对内毒素休克、血管扩张型休克有较好的作用［2］，同时有研究显示AVP与去甲肾上腺素（NE）合用可明显改善脓毒性休克和血管扩张型休克血压和组织灌流。本实验室前期研究发现，AVP与NE合用对非控制性失血性休克彻底止血后有较好的复苏效果，可明显改善休克血流动力学指标，延长存活时间，但其机制如何，目前尚不清楚。本研究采用非控制性失血性休克大鼠模型，观察AVP与NE合用对非控制性出血性休克大鼠彻底止血后肝、肾线粒体功能和血流量的影响，以初步探讨AVP与NE合用改善非控制性出血性休克的机制。

　　材料与方法

　　1  动物分组及试剂    　　SD大鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)240只，雌雄各半，体重（205.7±18.1）g。制作休克模型，分为乳酸林格氏液（LR）组、NE组、AVP(sigma,美国)0.4 U/kg组、AVP   0.04U/kg组、AVP  0.4U/kg+NE组、AVP 0.04 U/kg+NE组，各组再分为休克前、休克末、低压复苏末、确定性治疗1小时、观察1小时5个时相点测定，每组每个时相点10只大鼠。实验前禁食、自由饮水。

　　2  模型制备    　　以3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔内注射麻醉。大鼠仰卧固定，左股静脉插管供输液，左股动脉插管供采血、测平均动脉压（MAP）。插管完成后，稳定10分钟。腹中线酒精消毒后剖腹，显露脾脏，用剪刀从脾动脉分支之间横行切断脾实质，并切断1条脾动脉分支，使血自由流至腹腔内，关闭腹腔。当MAP降至40mmHg时（第Ⅰ期），开始进行低压复苏。根据本实验室前期研究结果，采用羟乙基淀粉和LR（HES+LR，按体积比1:2）混合液进行低压复苏，使MAP维持在50mmHg 1小时（第Ⅱ期）。低压复苏完毕后，结扎血管彻底止血，清理腹腔内积血，并计算出血量。

　　3  AVP与NE合用对肝、肾线粒体和血流量的影响    　　大鼠在彻底止血后，采用不同治疗措施进行确切性治疗（第Ⅲ期），LR组输注2倍失血量的LR溶液；NE组、AVP  0.4U/kg组和AVP 0.04U/kg组大鼠彻底止血后在2倍失血量的LR溶液中分别加入NE（3μg/kg）、AVP(0.4U/kg或0.04U/kg)、AVP  0.4U/kg+NE或AVP  0.04U/kg+NE组在1倍失血量的LR溶液中加入NE（3μg/kg），再在1倍失血量LR溶液中加入AVP(0.4U/kg或0.04U/kg)输注。输注速度为20ml/h。在休克前，第Ⅰ期末、第Ⅱ期末、第Ⅲ期1小时以及观察期（第Ⅳ期）1小时，分别观察肝、肾血流量和线粒体功能。休克大鼠在所需测定时相点时，正中剖腹充分暴露右肾和肝叶，用激光多普勒血流量测定仪(Feriflux system 5000,Perimed)测定肝、肾血流量，而后采用空气注射方式处死大鼠，取适量的肝、肾组织测定线粒体功能。肝、肾线粒体功能以呼吸控制率［即在有或无二磷酸腺苷（ADP）条件下消耗氧的比率］表示。    　　线粒体功能测定方法：大鼠处死后，取约5g肝或肾组织置于冰的分离液中(庶糖0.25mol/L,Na2EDTA 0.1mmol/L,Tris 0.01mol/L,pH7.6)，充分剪碎反复洗涤清除残血，而后进行组织匀浆，离心600g，12分钟，4℃，收集上清继续离心25000g，15分钟，4℃，收集沉淀，测定线粒体。用782溶氧测定线粒体功能，30°C恒温，校准，加入30°C的测定介质（Tris 0.2mol/L,pH 7.6,KCl 15mmol/L,KH2PO4 15mmol/L,Na2EDTA 1mmol/L,MgCl2 5mmol/L,庶糖0.25mol/L)）400μl，平稳后注入40μl的线粒体悬液。待氧浓度曲线的斜率稳定以后(即第1状态呼吸), 再注入0.2mol/L的丁二酸钠溶液50μl,当氧浓度曲线再次出现稳定的斜率以后(即第2状态呼吸),用微量注射器注入10μl ADP溶液。ADP加入后刺激线粒体呼吸,耗氧率剧增,斜率增大,此时的呼吸称为第3状态呼吸。加入的ADP耗尽后,耗氧率又自动减慢,这时的呼吸称为第4状态呼吸。此时再重复加入ADP进行第3状态的测定,直至反应液中溶解氧耗尽为止。呼吸控制率(RCR)的计算：根据氧浓度曲线的斜率，实验处理软件可自动计算出第3态呼吸的耗氧率和第4态呼吸的耗氧率，将第3态呼吸耗氧率除以第4态呼吸的耗氧率即为呼吸控制率。

　　4  统计学处理    　　实验数据以±s表示，组间比较采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析。P<0.05为统计学差异显著。

　　结果

　　1  AVP与NE合用对肝、肾线粒体功能的影响    　　肝线粒体功能在休克末（第Ⅰ期末）和低压复苏末（第Ⅱ期末）有轻度降低，输注LR、NE以及AVP  0.04U/kg后，肝线粒体功能与复苏前比无明显改善；AVP   0.4U/kg输注后，肝线粒体功能在复苏1小时（第Ⅲ期）和观察期明显改善，明显高于NE组和LR组（P<0.05）；AVP   0.4U/kg或0.04U/kg与NE合用后，肝线粒体功能明显改善，与AVP  0.4U/kg或0.04U/kg组相比显著升高（P<0.05）（见图1a）。    　　肾线粒体功能与肝线粒体功能不同，在休克末和低压复苏末均明显低于休克前，LR、NE、AVP   0.04U/kg或0.4U/kg复苏均不能改善肾线粒体功能，甚至有所降低，AVP   0.04U/kg或0.4U/kg与NE合用后，肾线粒体功能降低受到明显抑制，与单纯AVP或NE组相比均明显升高（P<0.05）(见图1b)。

　　2  AVP与NE合用对肝、肾血流量的影响    　　在休克末，低压复苏末肝、肾组织血流量均明显降低，LR、NE以及AVP  0.4U/kg复苏均不能很好地改善肝、肾组织血流量；AVP  0.4U/kg或0.04U/kg与NE合用后，明显增加肝、肾组织血流量，明显高于NE组、AVP   0.4U/kg或0.04U/kg组（P<0.05）(见图2a、b)。 　　与LR组相比：*P<0.05；与 NE组相比：^P<0.05;与AVP 0.4U/kg组相比：$P<0.05;与AVP 0.04U/kg相比:@P<0.05

　　图1  AVP与NE合用对肝（a）、肾（b）线粒体功能的影响（略）

　　与LR组相比：*P<0.05；与 NE组相比：^P<0.05;与AVP 0.4U/kg组相比：$P<0.05;与AVP  0.04U/kg相比:@P<0.05

　　图2  AVP与NE合用对肝（a）、肾（b）血流量的影响 （略）

　　讨论    　　AVP抗休克作用以往集中在对血管扩张型休克和脓毒性休克，本实验室前期研究发现AVP对重症失血性休克有明显的作用［3，4］。有关非控制性出血性休克在彻底止血前研究较多，提出了新的救治原则和方案，前期研究表明对非控制性出血性休克彻底止血后不同救治措施具有明显不同的效果，AVP与NE合用与单纯升压药以及与AVP单用比，能明显改善动物血流动力学指标，延长存活时间，但其机制如何，本实验进行了相关研究。研究结果发现休克后在低压复苏期，肝、肾线粒体功能和血流量均明显降低，单用LR、NE、AVP  0.4U/kg或0.04U/kg不能有效地改善休克动物线粒体功能和血流量，AVP与NE合用可明显改善休克动物肝、肾线粒体功能和组织血流量，说明AVP与NE合用对非控制性出血性休克的有益作用与其改善重要组织器官的线粒体功能和组织血流量有关。    　　以往研究认为AVP抗休克作用与其降低一氧化氮的合成而抑制KATP（ATPdependent K+channel）有关［5，6］。本实验室在前期研究中发现AVP对控制性出血性休克可明显改善动物血流动力学指标［7］，延长存活时间，其机制与AVP通过激活Rho激酶（Rho kinase）而增加血管平滑肌细胞钙敏感性和血管反应性有关。本研究发现AVP与NE合用可能通过改善重要器官线粒体功能和血流量来发挥其抗休克作用。

【参考文献】　　［1］Oliver G.On the physiological of extracts of the pituitary and certain other glander organ［J］.J Physiol,1985,18（7）:27-31.

　　［2］Voelckel WB,Lurie KG,Lindner KH.Vasopressin improves survival after cardiac arrest in hypovolemic shock［J］.Anesth Analg,2000,91（3）:627-634.

　　［3］李涛,徐竞，杨光明，等.精氨酸血管加压素对失血性休克大鼠的作用［J］.创伤外科杂志，2008，10（3）：211-213.

　　［4］杨光明，李涛，徐竞，等.参与AVP改善休克血管低反应及钙失敏的PKC亚型及其机制［J］.中国危重病急救医学，2008，20（3）：133-137.

　　［5］Wakatsuki T,Nakaya Y,Inoue I.Vasopressin modulates K+channel activities of cultured smooth muscle cells from porcine coronary artery［J］.Am J Physiol,1992,263（5）:491-496.

　　［6］Umino T,Kusano E,Muto S.AVP inhibits LPSand IL1 beta-stimulated NO and cGMP via V1 receptor in cultured rat mesangial cells［J］.Am J Physiol,1999,276（4）:F433-441.

　　［7］方玉强，李涛，刘良明.精氨酸血管加压素抗失血性休克作用及其与Rhokinase的关系［J］.第三军医大学学报，2008，30（13）：1223-1226.