组织蛋白酶K与人椎间盘退变相关性研究

作者：王宗亮，刘雅，蔡明，王敏，王尚，史建刚    作者单位：1.南阳市骨科医院脊柱外科，河南 南阳 473000；2.第二军医大学附属长征医院骨科，上海 200003 　　【摘要】  目的 检测正常和退变人椎间盘细胞中组织蛋白酶K(CathK)的表达，探讨CathK与椎间盘退变的相关性。方法 用免疫组化SP法和ELISA法对30例腰椎间盘突出症患者椎间盘组织中CathK进行检测,并取15例健康成人(尸体)和脊柱骨折手术患者正常椎间盘组织作对照。结果 正常组15例和退变组30例椎间盘中均有CathK表达,退变组表达水平明显高于正常组,差异显著(P<0.05 ) 。结论 CathK可能参与了椎间盘退变的病理改变。

　　【关键词】  组织蛋白酶K;椎间盘;基质

　　Relationship between cathepsin K and intervertebral disc degeneration in human

　　WANG Zongliang,LIU Ya,CAI Ming,et al.

　　（Department of Spinal Surgery,Orthopaedics Hospital of Nanyang,Nanyang  473000,China）

　　Abstract：  Objective  To detect the expression of cathepsin K in  the cells of normal and degenerative intervertebral disc in humans,and to explore the relationship between them.Methods  Immunohistochemical SP method and ELISA method were used to detect the expression of cathepsin K,containing of 30 specimens of intervertebral disc tissues of  patients with prolapse of lumber intervertebral disc.The control group consisted of 15 healthy adults(cadaver) and surgical patients with spinal fracture,whose intervertebral disc tissue was normal.Results  Fifteen specimens in normal group and thirty specimens in degeneration group all had cathepsin K expression.The expression in degeneration group was significantly higher than that of control group.The difference was significant(P<0.05).Conclusion  The cathepsin K may play a role in the pathological process of intervertebral disc degeneration.

　　Key words:cathepsin K;intervertebral disc;matrix

　　组织蛋白酶K(cathepsin K,CathK)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶，其基因定位于染色体1q21.2,存在于多种组织细胞中，参与结缔组织的分解代谢，通过对比检测CathK在正常与退变椎间盘中的表达，探讨CathK与椎间盘退变关系，国内外均未见相关文献报道。我们这次采用免疫组化SP法和酶联免疫法（ELISA）检测CathK在人椎间盘细胞中的表达，并进一步探讨CathK与椎间盘退变的相关性，为椎间盘退变机制的研究及延缓和治疗椎间盘退变提供理论依据。

　　材料与方法

　　1  临床资料及分组

　　实验所用椎间盘标本取自术中（2006年10月～2007年3月在本院骨科手术治疗的患者）及新鲜尸体。退变组30例，取自腰椎间盘突出症行显微内窥镜椎间盘摘除术（MED）患者，男性18例，女性12例；年龄25～76岁，平均52岁。正常组15例，取自无椎间盘突出症的脊柱骨折手术自愿捐献患者和健康成人（尸体），男性10例，女性5例；年龄17～40岁，平均23岁。术中所取标本经MRI T2加权信号改变，尸检标本经病理检查验证所取标本的可靠性。鼠抗人CathK单克隆抗体（即用型）和SP免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，CathK Elisa试剂盒购自Endogen公司。

　　2  方法

　　免疫组化染色及结果判断：5μm石蜡切片经脱蜡、脱二甲苯、水化后用体积分数3%的H2O2室温孵育15分钟，封闭内源性过氧化氢酶，抗原修复后PBS浸泡冲洗3次，每次3分钟，滴加抗体后置于4°C冰箱过夜。免疫组织化学染色程序严格按说明书进行。每批均设立阴性及阳性对照，PBS缓冲液（配方：pH 7.4,KH2PO4,Na2HPO4,Nacl,Kcl）代替一抗作阴性对照，已知染色阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照。结果判断：CathK阳性染色定位于细胞浆，呈棕黄色染色为阳性。计数阳性细胞百分率和观察染色强度，以二者乘积得分作为阳性强度判断依据。随机选取5个高倍（放大400倍）视野，阳性细胞百分比＜15%计“0”分，16%～50%计“1”分，51%～70%计“2”分，＞70%计“3”分。着色强度为淡黄色计“1”分，棕黄色计“2”分，棕褐色计“3”分。两项相乘之积为0～1分计为“阴性”，2～3分计为“弱阳性”，4～5分计为“中度阳性”，6～7分计为“强阳性”。

　　3  ELISA法定量检测

　　将正常和退变两组冷冻的椎间盘标本取出，按质量比9：1比例加入0.86%冷生理盐水研磨，制成10%组织匀浆，以3000r/min×15分钟离心，取上清液进行检测，检测过程严格按试剂盒说明书进行，最后在酶标仪上读取OD值，按标准品OD值及相应浓度绘制曲线图，在曲线图上按检测到的CathK OD值查出相应的CathK浓度值。

　　4  统计学处理

　　免疫组化实验数据用等级资料的非参数秩和检验。ELISA实验数据均用±s表示，用两样本比较的t检验进行统计学处理，所有统计分析在SPSS13.0统计软件包上进行。P<0.05为有统计学意义。

　　结  果

　　1  免疫组化染色显示,CathK染色定位于细胞浆。在实验组中,多数标本CathK阳性细胞较多,阳性率> 60%(图1);在对照组中,CathK阳性细胞较少,阳性率<20%（图2）。非参数秩和检验统计学处理显示两组间差异显著(P<0.05),有统计学意义。

　　2  ELISA实验数据用两样本的t检验进行差异性比较，结果实验组含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

　　讨  论

　　椎间盘退变被认为是椎间盘突出症等疾病的病理基础，人们已从分子生物学、生物化学、免疫学等不同角度对椎间盘退行性变进行了深入而细致的研究，但对其确切机制尚无定论，仍有大量的工作需进一步完善。基质金属蛋白酶（MMPS）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPS）两个酶系统在椎间盘细胞外基质改变过程中发挥着重要作用，除MMPS外，其它对细胞外基质有降解作用的蛋白酶也可能参与了椎间盘的退变过程。

　　CathK是一种溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶，其基因定位于染色体1q21.2，存在于多种组织细胞中，目前发现CathK不仅表达于破骨细胞，而且也可由成骨细胞产生［1］，另外在炎性肉芽肿、肺部、甲状腺滤泡上皮细胞、子宫内膜、脂肪组织均有分布，以无活性的形式从细胞内分泌出来，经溶蛋白性裂解作用将前端肽从氨基端裂解后转换为活性型的CathK［2］，具有蛋白水解酶作用。

　　CathK最适pH值为酸性（pH＜7），而基质金属蛋白酶（MMPS）最适pH值为中性或碱性［3］。体内实验证实退变间盘内的pH值介于5.7～6.3之间［4］。椎间盘是全身最大的无血运组织，其营养物质的吸收和代谢产物的排出主要依靠软骨终板的渗透作用，随着年龄的增长，软骨终板逐渐钙化且外周血管的数量进行性减少，阻止了髓核营养物质的进入和代谢废物的排出，此时无氧代谢加强，乳酸堆积，细胞外环境pH值降低，这种酸性环境不但损害了细胞的新陈代谢，影响了细胞的生物合成功能，还为CathK发挥细胞外蛋白水解酶作用，降解细胞外基质提供了适宜条件。这说明了二者在降解细胞外基质的过程中CathK可能发挥了更重要的作用。本次实验证明CathK在退变椎间盘内的表达明显高于正常椎间盘，二者差异具有显著性。Konttene等［5］研究证明Cathepsin家族中的Cathepsin G在退变椎间盘中阳性表达明显高于正常椎间盘，并提出Cathepsin G在椎间盘退变中有降解椎间盘的作用。已知Cathepsin家族参与结缔组织的分解代谢。这些都为CathK参与了椎间盘退变提供了直接或间接的理论依据。

　　虽然本次实验证明CathK在退变椎间盘中表达上调，但是CathK的调控因子及其抑制、活化机制，以及与其它Cathepsin家族成员的相互关系都有待进一步阐明，以便为椎间盘退变机制的研究及延缓和治疗椎间盘退变提供更多的理论依据。

　　【参考文献】［1］Mandelin J,Hukkanen M,Li TF,et al.Human osteoblasts produce cathepsinK［J］.Bone,2006,38（6）：769-777.

［2］Yang J,Shang GD,Zhang YQ,et al.Study of a novel antiosteoporosis screening model targeted on cathepsin K［J］.J Biomed Environ Sci,2004,17（3）:273-280.

［3］Konttinen YT,Mandelin J,Li TF,et al.Acidic cysteine endoproteinase cathepsinK in the degeneration of the superficial articular hyaline cartiliage in osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum,2002,46(4):953-960.

［4］Nachemson A.Intradiscal measurements of pH in patients with lumber rhizopathies［J］.Acta Orthop Scand,1969,40(1):23-42.

［5］Konttiene YT,Kaapa E,Hukkanen M,et al,Cathepsin G in degenerating and healthy discal tissue［J］.Clin Exp Rheumatol,1999,17(2):197-204.