核因子κB与腹部开放伤合并海水浸泡大鼠全身炎症反应综合征的关系

作者：王育红 刘刚 虞积耀 孟宇宏 张夕凉 周丽君 王大鹏    作者单位：海军总医院普通外科，北京 100037；海军总医院海战伤救治研究中心，北京 100037；海军总医院病理科，北京 100037 　　【摘要】  目的 探讨腹部开放伤合并海水浸泡大鼠全身炎症反应综合征（SIRS）发生时核因子кB(NFкB)的活性与SIRS的关系。方法 采用腹部开放伤合并海水浸泡大鼠致伤模型并诱发SIRS。酶联免疫吸附（ELISA）法检测血肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL6）水平，免疫组化技术检测NFкB在外周血淋巴细胞（PBL）和小肠组织中的活性。结果 腹部开放伤后海水浸泡1小时，大鼠出现SIRS；血TNFα、IL6水平升高；免疫组化显示大鼠PBL和小肠组织中NFкB表达的阳性率显著升高，与对照组比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 腹部开放伤合并海水浸泡可致大鼠SIRS，NFкB和细胞因子参与了SIRS的发生、发展。NFкB 的激活介导了TNFα、IL6等细胞因子的释放，在SIRS中可能处于中心环节。

　　【关键词】  腹部损伤 海水浸泡 核因子кB 全身炎症反应综合征

　　肠道在多器官功能障碍综合征（MODS）发生发展过程中具有重要作用［1-3］，肠黏膜屏障功能受损所引起的细菌易位和内毒素血症已成为全身炎症反应综合征(SIRS)的重要诱因，进而启动MODS并危及生命。海水浸泡伤具有以下特点：血液出现高钠、高氯、高渗状态，以及严重的水、电解质紊乱，伴有代谢性及呼吸性酸中毒［4，5］。核因子кB(nuclear factor kappaB，NFкB) 是一种普遍存在的快反应转录因子。NFкB激活后，可启动和调控一系列参与炎症反应的细胞因子基因的表达。本研究拟从大鼠腹部开放伤海水浸泡模型中，观察NFкB的活化与肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）的变化，探讨大鼠腹腔海水浸泡损伤中SIRS的作用机制。

　　材料与方法

　　1  动物模型及分组    　　健康雄性Wistar大鼠50只，体重（230±20）g，清洁级，随机分为5组，每组10只。A组：腹部开放伤合并海水浸泡组；B组：单纯腹部开放伤组；C组：单纯海水浸泡组；D组：腹部开放伤合并生理盐水浸泡组；E组：正常对照组。大鼠腹腔麻醉成功后取仰卧位，沿中下腹部正中切开约3cm进腹，用自制硬质铁网片撑开并固定以防止内脏的脱出，造成人为的腹部开放性伤；将大鼠直立浸泡于22℃海水浴中1小时。人工海水根据国家海洋局第三研究所提供的我国东南沿海海水配方配置。

　　2  观察指标和方法

　　2.1  观察各组大鼠直肠温度，心率，呼吸及外周血白细胞计数。

　　2.2  肠黏膜组织取材：在距回盲部5cm处取2cm长的小肠组织，常规固定、脱水，垂直定向石蜡包埋，垂直切片，动物标本均连续切片20张，切片厚度为4μm，留作光镜及免疫组化实验用。

　　2.3  肠黏膜上皮NFκB检测：抗NFκB/p65单克隆抗体购自Thermo Scientific公司，工作浓度1：100。正常胎盘组织作为阳性对照。采用Envision两步法进行（按说明书操作）。结果判定：细胞核上呈现棕黄色为阳性，未见着色细胞者为阴性。每一玻片任选5个高倍视野（×400），计算阳性细胞百分率（阳性细胞数/计数细胞总数×100％）。

　　2.4  血淋巴细胞涂片制备  使用密度梯度离心法，用细胞离心甩片机 （英国Shandon 公司）将细胞离心至玻片，形成直径1cm的细胞膜，固定于40g/L的多聚甲醛。 血淋巴细胞免疫组化操作与组织切片大体相同。

　　2.5  血TNFα、IL6 水平的测定：夹心法固相酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定。操作步骤按照试剂盒说明书进行(试剂盒购自Biosource公司).

　　3  统计学分析    　　实验数据用均数±标准差（±s）表示，数据采用SPSS 12.0 统计软件进行方差分析和q检验。某些观察指标间的相关性用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　结果

　　1  SIRS模型观察    　　目前尚缺乏动物SIRS的诊断标准。按文献标准［6］,在人类SIRS临床诊断依据的基础上，提出以下动物SIRS的诊断依据：（1）直肠温度较正常或伤前升高或降低1℃；（2）呼吸频率超过对照值2倍或PaCO2较对照值降低25%；（3）白细胞总数超过对照值的2倍或减少50%；（4）心率较对照值增加50%。上述几项中，采用直肠温度、PaCO2、白细胞计数和分类的变化进行诊断相对较为准确。动物发生SIRS时，心排血量减少，外周阻力增加，氧耗量和氧摄取增加，血浆急性期蛋白和多种炎性介质(如肿瘤坏死因子、白细胞介素和磷脂酶A2等)水平升高；多脏器组织呈炎症改变。各组大鼠致伤1小时后观察直肠温度、心率、呼吸、外周血白细胞计数。腹腔海水浸泡组大鼠不同程度出现直肠温度下降，心率增快，呼吸频率降低，外周血白细胞数量减少，达到动物SIRS的诊断标准。

　　2  大鼠血细胞因子的变化    　　腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠血TNFα和IL6浓度较对照组显著升高(P<0.01)，B组血TNFα浓度较E组显著升高(P<0.01)；而与B组比较，C、D组无显著差异(P>0.05)，A组血TNFα浓度有明显差异(P<0.01)。B、D组血IL6浓度较E组升高(P<0.05)；C组血IL6浓度较E组无显著差异(P>0.05);而与B组比较，C组血浆IL6浓度升高(P<0.05)，D组无显著差异(P>0.05)。结果见表1。

　　3  大鼠外周血淋巴细胞和肠黏膜组织NFκB活性的变化    　　腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠外周血淋巴细胞和肠黏膜NFκB阳性率较E组显著升高(P<0.01)，B、D组较E组显著升高(P<0.01)；而与B组比较，D组无显著差异(P>0.05)。C、E组有显著差异(P<0.01)。C、E组之间无显著差异(P>0.05)。E、C组均明显低于A、B、D组(P<0.01)，D组显著低于A组(P<0.01)。结果见表1。

　　4  肠黏膜NFκB与血TNFα、IL6的相关性    　　腹腔海水浸泡伤组大鼠肠黏膜组织中NFкB的活性与血TNFα水平呈明显正相关 （r=0.703，P<0.01 ）。腹腔海水浸泡伤组大鼠肠黏膜组织中NFкB的活性与血IL6水平呈明显正相关（r=0.738，P<0.01 ）。

　　表1  海水浸泡合并腹部开放伤大鼠某些指标的变化（略）

　　与E组比较：aP<0.01，bP<0.05，cP>0.05；与B组比较：dP<0.01，eP<0.05，fP>0.05

　　讨论    　　随着创伤及危重医学的发展，人们逐渐认识到肠道不仅仅是消化和吸收器官，还是阻止肠腔内细菌、毒素等有害物质侵入体内的重要屏障。肠道黏膜是创伤的易损靶器官，肠道是创伤后全身炎性反应的始动器官，产生SIRS，还可能对其他脏器造成继发性损伤，甚至发生MODS。    　　NFкB是多种炎症介质的上游信号分子，其激活后可促进多种炎症介质的产生，处于调节炎症反应的中心环节。细胞处于静息状态时，NFкB以非活性形式存在于胞浆中，由P50P65异二聚体和NFкB抑制蛋白（IκB）组成。胞外刺激通过一个或多个信号途径使NFкB三聚体复合物中的IκB磷酸化而解离，游离的IκB与蛋白结合发生泛素化，最后经蛋白酶小体降解，NFкB二聚体从胞浆中移位至胞核内，与靶基因结合，从而启动某些基因的转录。内毒素、缺血再灌注损伤(I/R)、氧自由基(ROS)以及严重创伤等因素使NFкB激活，进入核内，调控众多细胞因子的基因表达，尤其是TNFα、IL1等原发性细胞因子的增加，进一步作用于巨噬细胞等产生大量的继发性细胞因子，如IL6、IL8等。有些细胞因子又进一步激活NFкB(其中TNFα、IL1β通过受体介导途径激活NFкB)形成正反馈的级联放大效应。NFкB通过影响炎症介质的基因转录而对炎症介质网络产生广泛作用。TNFα是NFкB介导表达的重要的促炎细胞因子，在炎症反应中是激活细胞因子级联反应的主要因子，在循环中较早出现并迅速达到高峰，TNFα还可以诱导中性粒细胞的激活，促进淋巴细胞与内皮的相互黏附，刺激趋化因子分泌，导致中性粒细胞在组织中聚集。TNFα反过来又可以激活NFкB，使细胞因子大量过度释放，引起SIRS或MODS 。临床研究证实，感染所致的SIRS与TNFα密切相关［7，8］。我们研究发现，腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠血TNFα浓度A组较对照组显著升高(P<0.01)，B组血TNFα浓度较E组升高(P<0.01)；而与B组比较，C、D组无显著差异(P>0.05)，A组血TNFα浓度有明显差异(P<0.01)。而且，A组大鼠PBL中NFкB 的活性与血TNFα水平呈明显正相关。     　　IL6是一种迟发性细胞因子，在感染性休克时血清IL6水平升高比TNFα延迟［9］。IL6 是急性相蛋白反应的主要诱导者，催化和放大炎性反应和毒性作用，造成组织细胞的损害，虽无疾病的特异性，但能直接反映各种类型损害的严重程度。有证据显示，血清中IL6水平可以作为细胞因子级联反应激活的一个标志，反映出宿主炎症反应与疾病严重程度间的关系，并且在脓毒症中可以作为判断预后的一个指标［10］。本研究显示，A组大鼠血IL6浓度较对照组显著升高(P<0.01)，B、D组血IL6浓度较E组升高(P<0.05)；C组血IL6浓度较E组无显著差异(P>0.05);而与B组比较，C组血IL6浓度升高(P<0.05)，D组无显著差异(P>0.05)。同时小肠组织病理观察也发现小肠充血、淋巴细胞浸润及肠上皮细胞间紧密连接破坏等改变。    　　在本实验中，我们采用腹部开放海水浸泡伤大鼠致伤模型。海水浸泡1小时后大鼠出现SIRS，同时提示NFκB在海水浸泡1小时后其活性显著升高，进一步研究发现，NFκB活性改变与TNFα、IL6浓度变化基本一致，从而提示NFκB可能在大鼠海水浸泡伤炎症发生中起关键性作用。

　　【参考文献】　　［1］董军,张淑文,王宝恩.肠功能障碍与多器官功能障碍综合征［J］.中国危重病急救医学,2005,17(12):764-767.

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　　［4］王育红,鹿尔驯,虞积耀,等.海水浸泡腹部开放性损伤对大鼠体液代谢的影响［J］.第二军医大学学报，2000,21(8):786-788.

　　［5］王育红，虞积耀，段蕴铀，等.犬腹部开放伤合并人工海水浸泡后重要器官的病理变化［J］.创伤外科杂志，2004，6（1）：34-37.

　　［6］胡森,盛志勇,周宝桐.MODS 动物模型研究进展［J］.中国危重病急救医学,1999,11(8):504-507.

　　［7］Gando S,Kameue T,Nanzaki S,et al.Cytokines,soluble thrombomodulin and disseminated intravascular coagulation in patients with systemic inflammatory response syndrome［J］.Thromb Res,1995,80(6):519-526.

　　［8］Bone RC.Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation［J］.Crit Care Med,1996,24(2):163-173.

　　［9］肖莉,王志强.细胞因子对感染性休克作用的新进展［J］.国外医学生理病理科学与临床分册，2003,23(1):100-102.