人参皂苷Rg1对6-OHDA所致MES23.5神经细胞损伤的保护

　　作者：王明波,陈文芳,谢俊霞　　作者单位：青岛大学国家生理学重点(培育)学科，山东 青岛 266071

　　【摘要】目的 探讨人参皂苷Rg1对6-羟基多巴胺(6-OHDA) 所致MES23.5神经细胞损伤的保护作用。方法 MES23.5细胞常规培养，观察人参皂苷Rg1预处理对6-OHDA毒性作用的影响，MTT法观察细胞存活率，实时荧光半定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)观察酪氨酸羟化酶(TH)和Bcl-2基因的表达情况。结果6-OHDA可剂量依赖性地损伤MES23.5细胞(F=71.24,P<0.01)，人参皂苷Rg1预处理可对抗6-OHDA的毒性作用(F=14.63，P<0.01);6-OHDA可明显降低TH和Bcl-2基因的表达，人参皂苷Rg1预处理可明显逆转上述改变(F=9.80、15.34，P<0.01)。结论 人参皂苷Rg1可明显对抗6-OHDA对MES23.5神经细胞的损伤，其作用机制可能与抗凋亡有关。

　　【关键词】 人参皂甙类,羟基多巴胺类,神经元,细胞保护

　　[ABSTRACT] Objective To study the protective effect of ginsenoside Rg1 against 6-OHDA-induced neurotoxicity in MES23.5 cells. Methods MES23.5 cells were routinely cultured and pretreated with ginsenoside Rg1 to determine the protective effect of Rg1 against 6-OHDA-induced neurotoxicity. The cell viability was observed by MTT method. The gene expressions of TH and Bcl-2 were detected by real time RT-PCR method. Results 6-OHDA induced cell death in a dose-dependent manner. Pretreatment with ginsenoside Rg1 had neuroprotective effects on cell viability against 6-OHDA-induced toxicity. 6-OHDA decreased the gene expressions of TH and Bcl-2. These effects could be reversed by Rg1 pretreatment. Conclusion Ginsenoside Rg1 has neuroprotective effects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in MES23.5 cells, its mechansim may be related to its anti-apoptosis effects.

　　[KEY WORDS] Ginsenosides; Hydroxydopamines; Neurons; Cytoprotection

　　帕金森病(PD)是一种常见的中老年人中枢神经系统慢性退行性疾病，其主要病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元进行性变性，引起黑质(SN)-纹状体(Str)通路DA水平降低[1,2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为其可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡机制等密切相关。目前对于PD尚缺乏有效的治疗方法，因此从不同的角度入手，探寻新的治疗方法是当前研究的热点。人参皂苷Rg1属于人参三醇类物质，是人参皂苷主要的活性成分之一。大量研究揭示，人参皂苷Rg1具有多种生物活性[3,4]，特别是在中枢神经系统，有抗衰老、抗氧化、益智及保护神经元免受毒性物质的损伤等作用。但人参皂苷Rg1对DA能神经元MES23.5细胞是否具有保护作用，目前尚未见报道。本实验应用6-OHDA损伤MES23.5神经细胞，建立PD的细胞模型，研究人参皂苷Rg1的神经保护作用，以期为PD的防治提供进一步的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及其来源

　　人参皂苷Rg1购自白求恩医科大学，其纯度为99.9%;DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);逆转录试剂盒购自Promega公司(美国);SYBR Green染料购自Bio Rad公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司，其余均为AR级。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。

　　1.2 细胞培养及药物处理

　　MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养。细胞汇合达80%~90%时，用6-OHDA处理细胞24或48 h，或Rg1预处理细胞24 h后，再用6-OHDA处理24或48 h，分为对照组(A组)、6-OHDA组(B组)、Rg1+6-OHDA组(C组)。

　　1.3 MTT法检测细胞生长

　　将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，用不同浓度6-OHDA处理细胞48 h，或先用10-8 mol/L Rg1预保护细胞24 h，再用6-OHDA处理，48 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中继续培养4 h，每孔加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率[5]。

　　1.4 实时荧光半定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测酪氨酸羟化酶(TH)和Bcl-2基因的表达

　　将传代细胞接种于6孔板中，用10-8 mol/L Rg1预保护细胞24 h，然后再用6-OHDA处理细胞24 h，Trizol法从细胞中提取总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录。采用SYBR green染料法相对定量检测TH、Bcl-2和GAPDH的基因表达。TH上游引物序列为5′-AAAATCCACCACTTAGAG-ACC-3′;下游引物为5′-TAGCCACAGTACCGTTCC-3′。Bcl-2上游引物序列为5′-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3′;下游引物为5′-CCCACTCGTAGCCCCTCT-3′。GAPDH上游引物序列为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′;下游引物为5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3′。用未处理的样本做标准曲线，计算出靶基因的含量，并与内参基因GAPDH相比。

　　1.5 统计学分析

　　数据以x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOV)。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度6-OHDA对MES23.5细胞的毒性作用及Rg1的保护作用 MES23.5细胞经0、1、10、25、50、75、100、200及400 μmol/L的6-OHDA处理48 h，细胞的存活率分别为1.000±0.143、0.985±0.070、0.927±0.048、0.820±0.068、0.785±0.054、0.763±0.052、0.678±0.048、0.601±0.030及0.234±0.039。6-OHDA可剂量依赖性地降低MES23.5细胞的生存率(F=71.24，P<0.01)。应用10-8 mol/L Rg1预处理细胞24 h，可明显降低100 μmol/L 6-OHDA的毒性作用(F=14.63,P<0.01)。

　　2.2 Rg1对6-OHDA诱导的TH基因表达的影响

　　100 μmol/L 6-OHDA处理细胞24 h可明显降低TH基因的表达，应用人参皂苷Rg1预处理24 h后，可明显增加TH基因的表达，差异有高度显著性(F=9.80,P<0.01)。

　　2.3 Rg1对6-OHDA诱导Bcl-2基因表达的影响

　　100 μmol/L 6-OHDA可明显降低Bcl-2基因的表达，而人参皂苷Rg1预处理组Bcl-2基因的表达较6-OHDA组明显增强(F=15.34,P<0.01)。

　　3 讨 论

　　PD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病理改变是SNzc DA能神经元进行性变性缺失。6-OHDA是公认的可以诱发DA能神经元变性的神经毒素，可以直接抑制线粒体电子传递链复合物，导致ATP耗竭细胞变性死亡;也可通过单胺氧化酶B生成过氧化氢，再由Fe2+经Fenton反应生成羟自由基，造成DA能神经元变性、凋亡[6]。本研究应用6-OHDA损伤细胞MES23.5这一DA能神经元细胞系，研究人参皂苷Rg1的神经保护作用及其机制。MES23.5细胞是一种杂交瘤性DA能神经元细胞系,由大鼠胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤-胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成，可替代原代培养的DA能神经元用于研究神经变性疾病PD[7]。

　　人参是我国传统名贵中药，具有广泛的药理作用。人参皂苷是人参的主要有效成分之一，可分三类：二醇型、三醇型、齐墩果酸型。Rg1属于三醇型人参皂苷，在人参皂苷中的含量丰富。药理学研究表明，Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用。

　　本研究结果显示，6-OHDA可剂量依赖性降低细胞的生存率，降低DA能神经元TH基因的表达，提示6-OHDA对MES23.5细胞具有毒性作用。应用Rg1预处理后，上述指标有明显改善，提示Rg1对MES23.5细胞有保护作用，可对抗6-OHDA的毒性作用。

　　Bcl-2是一种凋亡抑制蛋白，在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用[8]。本研究显示，6-OHDA可以引起Bcl-2基因表达的降低，表明6-OHDA促进MES 23.5细胞凋亡作用。而人参皂苷Rg1预处理后，Bcl-2基因的表达可明显升高。有研究表明，Bcl-2基因的编码区含有雌激素反应元件，我们的前期实验证实，人参皂苷Rg1可以通过激活雌激素反应元件，发挥类雌激素样作用[9]。人参皂苷Rg1对6-OHDA诱导的MES23.5细胞凋亡的保护作用，可能与其类雌激素样特性有关。

　　综上所述，本研究首次揭示人参皂苷Rg1可明显对抗6-OHDA对MES23.5细胞的毒性作用，其作用机制可能与抗凋亡有关。

　　【参考文献】

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