cfos和cmyc原癌基因在烧伤创面修复中的表达变化

　　作者：隋志甫 魏壮 李 文 刘飙 作者单位：解放军北京军区总医院美容整形中心，北京 100125

　　【摘要】 目的 探讨烧伤后创面组织原癌基因cfos和cmyc的表达顺序及分布规律。方法 应用免疫组化方法对18例烧伤患者断层供皮区创面愈合中cfos和cmyc原癌基因表达变化进行动态观察，并进行了半定量分析。结果 烧伤创面愈合中cfos、cmyc原癌基因有明显的规律性表达变化，但两者的表达模式不尽相同。正常皮肤即有cfos表达，伤后3 h达峰值，其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮成纤维细胞的胞核内。cmyc表达在伤后4 d达最高值，其阳性颗粒主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中。结论 烧伤可以诱导皮肤创面组织原癌基因cfos、cmyc表达，其表达具有时相与部位分布特征。这表明cfos和cmyc作为调控因子参与了临床创面修复过程，合理调控其表达有助于临床创面修复。

　　【关键词】 烧伤,原癌基因,免疫组化

　　近年研究认为，原癌基因在早期胚胎发育、细胞生长、分化和组织损伤修复过程中起重要作用。机体在缺血、缺氧、热体克、辐射和应激等情况下都可以诱导cfos、cmyc等一过性表达，故又被称为“早期即刻基因”〔1〕。既往动物试验证明：创面愈合中cfos和cmyc原癌基因有明显的规律性表达变化，且与创面愈合过程明显相关〔2〕。本研究采用免疫组化技术，探讨临床烧伤病人创面愈合中cfos和cmyc原癌基因表达变化及其与创伤的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源及制备 自2003年6月～2007年6月选取大面积烧伤病人(烧伤面积50%以上)创面共18例，男11例，女7例，年龄39～66岁，供区创面位于下腹部和大腿，经组织学证实均为深Ⅱ度创面，患者无特殊疾患。每一病例经知情同意后，分别于伤后3、6 h、1、4、10和16 d时局麻下用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少量皮下脂肪在内的标本，正常皮肤作对照。分别置于10%中性福尔马林和4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成5 μm组织切片备用。

　　1.2 两种原癌基因的免疫组化检测 石蜡切片经乙醇脱蜡入水，3%H2O2 37℃孵育10 min，以消除内源性过氧化氢酶活性。于0.01 mol/L，pH6.0柠檬酸盐缓冲液行抗原热修复。5%正常山羊血清封闭后加入适量稀释的cfos兔源性一抗4℃充分孵育过夜，经0.01 mol/L PBS漂洗，加入生物素标记的羊抗兔为二抗，37℃孵育30 min后，经0.01 mol/L PBS充分漂洗，加入链酶亲和素、生物素、过氧化物酶复合物混合成的标记物混合物，37℃下孵育30 min，充分洗涤后，以二氨基联苯氨(DAB)显色，经苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片，同时设无一抗的空白对照。cmyc蛋白免疫组化检：冰冻切片5 μm，室温放置30 min后，滴加10%福尔马林固定10 min，0.01 mol/L PBS漂洗，3%过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶活性，以下接石蜡切片免疫组化步骤。显微镜下观察，阳性颗粒为棕黄色。400倍光镜下测定其相对含量，每组选择5张切片，每张切片连续记数5个视野，求出每个视野内阳性细胞平均数。

　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，采用Student t检验。

　　2 结 果

　　2.1 创面组织cfos表达 正常皮肤即有cfos表达，其阳性细胞散在分布于表皮基底细胞胞浆，毛囊周围以及部分皮下成纤维细胞，但阳性表达较弱。cfos于伤后3 h表达水平最高，以后逐渐下降，1 d以后降至最低水平，10 d时恢复到正常水平，主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮层成纤维细胞胞核中内。伤后3 h，cfos原癌基因表达比正常皮肤和伤后1 d明显增强(P<0.01)(见图1)。

　　图1 创面愈合过程中cfos和cmyc蛋白表达

　　2.2 创面组织cmyc表达 正常皮肤内仅有少量的cmyc阳性细胞;伤后1 d即有明显的表达，主要分布在真皮层的成纤维细胞胞浆中内，多较松散稀疏分布;伤后4 d时表现为强阳性表达，创面的全层均可见有表达，多较密集分布，除主要分布在真皮层的成纤维细胞胞浆外，在创缘上皮基底细胞胞浆、毛细血管内皮细胞和残存的皮肤附属上皮细胞中尚可见分布;伤后4 d cmyc原癌基因表达比伤后1和10 d明显增强(P<0.01);伤后1和10 d比较无明显差别(P>0.05)(见图1)。

　　3 讨 论

　　皮肤烧伤修复的基本病理过程包括皮肤和肉芽组织的再生两方面，其中细胞的增殖与迁移是创伤修复过程中极为重要的细胞反应。cfos是存在于细胞内能编码的关键性调控蛋白的原癌基因。cmyc最重要的生物学功能是促进细胞周期进展。在静止期细胞，cmyc的表达几乎检测不到。但在有丝分裂原的刺激下，cmyc mRNA和蛋白的表达被迅速诱导，并促使细胞进入G1期。之后，cmyc的表达维持在相对稳定的水平。因此，cmyc原癌基因表达被看作是细胞有丝分裂的中介物〔3〕。既往动物试验研究表明，许多因素如缺血、缺氧都可以诱导原癌基因cfos与cmyc一过性表达。Chen〔2〕等利用手术结扎兔膀胱的一侧动脉造成膀胱缺血模型，发现cfos在伤后1 h即有表达，cmyc在伤后6 h即可探测到。本研究表明烧伤导致cfos和cmyc被激活并主要涉及修复过程的初、中期阶段。cfos和cmyc在伤后迅速增高这可能是其参与了细胞修复功能的激活。伤后4 d，cmyc原癌基因的高强度表达正与细胞增殖组织修复快速时期相一致;伤后16 d时，创面已基本愈合，虽然细胞增殖仍在进行，但cmyc基因表达已明显减弱。这与机体为避免组织过度增生所产生的“接触性抑制”相一致，有很强的积极意义。在整个愈合过程中，cfos和cmyc蛋白均有不同程度的表达，其表达在创面上皮基底细胞、真皮浅层成纤维细胞、残存的毛囊、汗腺、皮脂腺的上皮以及毛细血管内皮细胞分布最多，这些是创面修复细胞增殖的活跃部位，cfos和cmyc蛋白在上述部位的高表达，表明了cfos和cmyc蛋白参与了烧伤病人创面修复中的细胞代谢和增殖。据报道：作为激活蛋白(activator protein1，AP1)转录因子的重要成分的原癌基因cfos蛋白，它与jun基因家族形成的异源二聚体蛋白是早期反应基因。在组织稳态和损伤修复方面，AP1可能是关键蛋白，决定下游众多的靶蛋白，同时还联系着间充质细胞与上皮〔4,5〕。也有报道称：包括bFGF在内的多种生长因子可以激活细胞络氨酸蛋白激酶，导致磷酸肌醇变化、胞内钙离子含量增加、cfos和cmyc原癌基因表达，最终引起一系列生物效应〔6,7〕。

　　以上表明cfos和cmyc原癌基因表达与多种生长因子在调控创面修复方面相互协调控制，共同作用影响组织的修复。这提示在临床创面愈合初、中期采取必要措施，调控cfos和cmyc原癌基因的合理表达，能够加快临床创面的愈合。

　　【参考文献】

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　　2 Chen M，Ralph B，Robert ML.Genetic and cellular response to unilateral ischemia of the rabbit urinary bladder〔J〕.J Urol，1996;155：7327.

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