人脂肪干细胞体外增殖的安全性评价

　　作者：陈光平，罗盛康，徐翔，孙中生，汪海滨 作者单位：1.广东省第二人民医院整形外科，广东广州510317; 2.广东医学院2006级研究生，广东湛江 524023

　　【摘要】目的 探讨体外培养条件下增殖的人脂肪干细胞是否具有做为种子细胞的安全性。方法 体外分离、培养人脂肪干细胞并传代，观察其生物学特性，分别对第4代及第12代的人脂肪干细胞用TRAP法检测端粒酶活性，并进行染色体核型分析。结果 新鲜分离和传代的人脂肪干细胞在体外培养12代的端粒酶活性呈阴性或者低水平表达，且未见染色体核型的改变。结论 体外分增殖过程中，人脂肪干细胞的端粒酶活性及染色体核型未发生异常变化，符合作为种子细胞安全性的要求。

　　【关键词】 脂肪细胞 间充质干细胞 端粒酶 染色体 细胞培养

　　In vitro security evaluation on proliferation of human adiposederived stem cells

　　CHEN Guangping,LUO Shengkang, XU Xiang, SUN Zhongsheng, WANG Haibin

　　1.Department of Plastic and Reconstructive Suergery,the Second People's Hospital of Guangdong Province, Guangzhou 510317, China

　　Abstract:Objective To investigate whether human adiposederived stem cells (hASCs) are suitable for seed cells in artificial culture.Methods The biological characteristics of the isolated and subcultured hASCs were observed,and the telomerase activity and karyotype analysis of the 4th and 12th subcultivation were detected.Results There were little expression of telomerase activity and no karyotypic change in the freshly isolated hASCs and their 12th subcultivation.Conclusion The telomerase activity and karyotype of in vitro cultured hASCs remain intact, suggestive of their security requirement of seed cells.

　　Key words:adipocyte; mesenchymal stem cell; telomerase; chromatosome; cell culture

　　近年来从人脂肪组织提取干细胞(human adipose derived stem cells,hASCs)因其具有易获得性、可迅速扩增、低免疫原型等特点，目前已成为组织工程中种子细胞研究的热点[1 2]。经证实在特定的条件下hASCs能分化成为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等，且具有自我更新能力与多向分化潜能[3]。但是人脂肪干细胞在体外进行分离培养并扩增的时候是否能满足作为种子细胞的安全性要求，是否能维持其原有的生理性状，目前少有这方面的研究。本文选取与细胞发生畸变密切相关的指标端粒酶活性及染色体核型对hASCs的安全应用性进行检测及评价，旨在将其更广泛的应用于组织工程领域提供更详尽的实验数据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织来源

　　实验所用脂肪来源于我科20～30岁大腿脂肪抽脂术的4例健康成人，均为女性，供体无传染病及内分泌疾病，平均脂肪抽吸物约150mL。

　　1.1.2 主要试剂和实验用品

　　DMEM高糖培养基、青链霉素原液、PBS、FBS、秋水仙素(Gibco公司)，胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、XTT、PMS(Sigma公司)，鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD105单克隆抗体(Caltag公司)，TeloTAGGG Telomerase PCRELISA试剂盒(Roche公司)，细胞培养瓶、培养皿、培养板(Corning公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 hASCs的分离、纯化和培养

　　无菌条件下将吸脂术中吸出的脂质部分用PBS反复冲洗，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化60min，等体积高糖DMEM+10%FBS中和酶活性，1100r/min离心5min。弃上清，重悬沉淀，200目筛网过滤，细胞悬液用细胞记数板计数，按2×104/培养瓶接种于25cm2培养瓶中，培养瓶加入完全培养基，37℃、5%(体积分数)CO2孵箱培养，每3天换液1次。细胞培养至80%融合时，用胰酶/EDTA消化并按1∶1的比例传代。同时，对不同时间点的hASCs进行形态学观察。

　　1.2.2 hASCs表面抗原分析

　　将上述培养第4代的hASCs经过消化，1100r/min离心5min后细胞重悬;细胞计数后将细胞浓度调整为1.5×106/mL，分别于人抗鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD105单克隆抗体室温反应30min，PBS洗涤后用流式细胞仪进行检测。

　　1.2.3 hASCs增殖速率的测定

　　将鉴定过的分别培养至第4代、12代的hASCs，各以每孔1.5×103细胞接种于96孔板内，加完全培养基200μL，设每组4个复孔。置37℃、5%(体积分数)CO2孵箱培养8d，每天取一组细胞，吸弃上清，每孔加50μL XTTPMS工作液，继续培养4h。振荡5min，以主波长450nm，参比波长630nm在酶标仪上比色，测定吸光度A值，取其均值，以时间为长轴，光吸收值为纵轴绘制出生长曲线，并计算细胞倍增时间。

　　1.2.4 hASCs增殖中端粒酶活性的测定

　　用TeloTAGGG Telomerase PCRELISA试剂盒按说明书(TRAP法)检测体外培养4代、12代的hASCs，同时以人胚肾细胞293细胞株细胞(293T)为阳性对照，干扰素为阴性对照(试剂盒内提供)。检测方法如下，取2×106个细胞，裂解细胞，取离心上清2μL进行端粒酶催化特异底物反应的PCR，PCR产物变性后用DIG标记的特异探针杂交，而后用偶联过氧化物酶的抗DIG抗体行ELISA反应，在酶标仪测定ELISA结果。测定波长为450nm和690nm吸光度(A)值，吸光度差值△A=A450A690，△A代表端粒酶活性。结果判断标准：阳性对照△A>1.5，阴性对照△A<0.25，待测样品△A值减去阴性对照△A值，△A>0.2者为阳性。采用SAS9.0软件包进行结果分析，测定值以均值±标准差表示。

　　1.2.5 hASCs的染色体核型分析

　　各取第4代和12代细胞，加入5g/L的秋水仙素(终质量浓度为0.04mg/L)，然后置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养5h，消化、离心，加入0.075%kcl，静置20min，加入少许固定液预固定后离心，然后固定30min，离心，滴片，干燥后Giemsa染色，烘干，显微镜下观察。以上各方法用不同样本细胞重复实验3次。

　　2 结果

　　2.1 hASCs细胞形态学观察

　　接种后hASCs在24h内开始贴壁，呈短梭形，2～3 d后细胞伸展呈长梭形，形态类似成纤维细胞，核椭圆形，较大。大约5d，细胞迅速生长并形成克隆，7～10d左右细胞近80%融合，出现致密的贴壁层(图1)。以后每3～4d传代1次。本实验传至15代，细胞形态及倍增时间无明显改变。

　　2.2 hASCs表面抗原分析

　　流式细胞仪hASCs的表面抗原分析显示，所培养的hASCs表面有粘附分子的表达，CD29、CD44、CD105阳性标记出现单峰，而CD34、CD45阴性表达(图2)。

　　2.3 hASCs的增殖速率

　　细胞生长曲线近似倒“S”形，在接种的前3d细胞处于滞留期，而后进入对数生长期，约在第6天达最高峰(图3)。经计算，细胞倍增时间约50h。体外培养第4代、第12代的hASCs增殖速率未见明显不同，表明其增殖能力在体外培养12代内并不随着培养时间延长而发生明显变化。

　　2.4 增殖中的hASCs端粒酶活性测定

　　体外培养第4代、12代的hASCs用TRAP法测定的端粒酶活性测定值均小于0.25，属于阴性范围。采用SAS9.0软件包进行结果分析，测定值第4代hASCs为(0.050±0.002)，第12代hASCs为(0.055±0.012)，阳性对照293细胞为2.1，阴性对照干扰素为0.048。详见图4。

　　2.5 增殖中hASCs染色体核型的分析结果

　　对体外培养的第4代、12代hASCs的染色体核型分析结果显示：在体外长期培养扩增的条件下，hASCs的染色体核型未发生易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化(图5)。图5 体外培养的1#样本第4代hASCs染色体核型未发生易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化

　　3 讨论

　　2001年，Zuk等[3]首次从人脂肪组织中分离出一种多向分化的干细胞，因其与骨髓间充质干细胞形态相似而称为脂肪组织来源的干细胞。它具有较强的增殖和多向分化潜能。有实验表明：脂肪干细胞还可以作为一个良好的基因治疗载体加以应用[4]。因此，hASCs可能是一个非常理想的应用于组织工程、细胞治疗甚至临床领域的种子细胞。我们培养的hASCs在形态上呈现出类似成纤维细胞的梭形，增殖过程中胞浆内未见到脂肪颗粒，与相关文献报道一致[56]。且在细胞多次传代后流式细胞表面抗原分析粘附分子CD29、CD44、CD105呈阳性，而造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45呈阴性，这证明培养的细胞具有干细胞表面的标记物。

　　目前关于种子细胞的应用研究基本都是在体外进行的，由于不能完全模拟体内微环境及各种细胞因子的水平不同，因而种子细胞的安全性受到了质疑。在体外条件下，hASCs作为种子细胞是否仍能继续维持其生物学特性的稳定性，是否不发生癌变或者其它的不安全性改变等研究报道不多，故本文对端粒酶活性和染色体核型这两个对判断细胞畸变具有代表性的指标作了检测。

　　端粒是染色体末端由TTAGGG重复序列和相关结合蛋白质所组成的特殊结构，主要作用是防止染色体末端降解、融合、重组及DNA损伤修复系统的异常识别，以维持染色体的完整性和基因组的稳定性[7]。端粒与细胞的增殖分裂能力密切相关。正常人体内细胞的端粒长度随着细胞的分裂增殖而逐渐缩短，当缩短至一定的关键长度时，将出现“Hayflick极限”的规律而衰老、死亡[8]。目前对人体内的端粒调控机制研究得最多的是端粒酶调控机制[9]。端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，由端粒酶催化亚单位(TERT)、RNA模板(TR)和端粒酶结合蛋白(TP1)所组成，它通过增加端粒末端的重复序列而维持端粒的长度[10]，从而维持端粒长度以保证细胞增殖力，因此端粒酶活性间接反映细胞增殖能力强弱[1112]。绝大多数人类肿瘤和永生化细胞系细胞表达高水平的端粒酶活性，而正常体细胞端粒酶表达水平很低。近年来有关端粒酶与肿瘤关系的研究表明：端粒酶活性的异常表达不仅能使细胞永生化，但也可能使细胞发生恶性转化成为癌细胞，已证明约80%的恶性肿瘤都存在较高的端粒酶活性[1314]。因此，端粒酶系统的激活与细胞衰老、永生化和恶性转化的形成密切相关。

　　本文对在体外培养条件下的4例不同的hASCs样本的第4代及第12代采用TRAP法进行端粒酶活性检测的。结果显示：第4代和第12代的hASCs在体外增殖过程中，其端粒酶总是处于TRAP法的阴性水平，与阴性对照组干扰素的检测结果相近。这从某种意义上，对体外条件下hASCs的应用提供了安全性的参考。而体外培养的第4代及第12代hASCs的增殖速率差异不明显，也验证了其端粒酶稳定性表达控制其增殖速率的可能，但其表达水平可能低于TRAP法的检测水平。

　　染色体核型的异常改变和癌症的发生有着密切关系。目前的研究已经证实肿瘤的发生与细胞染色体互易、缺失、插入和倒位致染色体特异性断裂点区域癌基因激活表达或抑癌基因缺失，导致相关编码蛋白异常和细胞生物学性状改变之间存在着必然的联系[15]。因此, hASCs在体外条件下分离培养、扩增数代后，其染色体核型是否发生异常改变，这与其作为组织工程种子细胞的安全性有着重要的关系。本文对体外培养的4例不同的hASCs样本的第4代及第12代采用Giemsa染色的结果表明：细胞核型均未发生易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化，为正常的细胞核型。由上可见，本文从分离培养的hASCs在体外进行增殖和分裂过程中其端粒酶是呈阴性或低于TRAP法检测水平的低水平表达，而不像肿瘤细胞那样持续高表达端粒酶活性。此外，其染色体核型也未见异常改变。这一研究预示体外培养的hASCs可能是安全的，为其进一步应用于各项研究提供了安全性指标及理论基础。

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