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《整形外科学》

脱细胞真皮基质的制备、作用机理、免疫原性及其在整形外科中的应用现状

发表时间:2010-05-25  浏览次数:641次

  作者:郑锦标(综述),梁杰,张培华(审校) 作者单位:广东医学院附属医院整形外科,广东湛江 524001

  【摘要】 本文对脱细胞真皮基质的制备方法、作用机理、免疫原性及其在整形美容外科领域中的应用做一综述。

  【关键词】 脱细胞真皮基质;烧伤;外科,整形

  脱细胞真皮基质( acellular dermal matrix,ADM)是近十年国内外兴起的一种新型组织代替物。这种基质是用物理、化学等方法将皮肤中的表皮层及细胞成分彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质而得到的,具有创面覆盖、组织缺损填充、引导组织再生和支架等作用。ADM由于完全没有了细胞成分和Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原的主要免疫活性,故一般不会诱发排斥反应。但ADM保留有正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质能为组织细胞的再生提供一个良好的支架结构。本文就近年来 ADM的制备方法、作用机理、免疫原性及在整形美容外科领域中的应用现状作一综述。

  1 ADM的制备方法

  ADM根据制备材料的来源不同分为同种异体真皮基质与异种真皮基质两种。同种异体真皮基质的制备材料为人类尸体皮肤,异种真皮基质主要来源于猪的皮肤。ADM的制备主要有以下3个步骤:表皮和真皮层分离、去真皮中的细胞成分和辅助制备措施。

  1.1 表皮和真皮层分离的方法

  目前多数学者采用酶消化和高渗盐水分离法分离表皮和真皮。酶消化法常用的消化酶有DispaseII和胰蛋白酶,胶原酶因价格昂贵而较少使用。DispaseII是从多黏杆菌中提取的一种中性蛋白酶,主要分解IV型胶原和纤维粘蛋白,可作用于表皮和真皮连接处,分离表皮与真皮快速有效。标本经DispaseII处理后,表皮真皮间的基底膜及皮肤附属器与周围结缔组织成分均被破坏[1]。胰蛋白酶作用在基底细胞和其上的细胞之间,破坏桥粒和半桥粒结构,但仍有部分表皮细胞成分残留[2]。高渗盐水分离法则是将标本浸泡于1mol/L氯化钠溶液中,利用高渗的原理,使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离,从而完整地去除表皮[3]。

  1.2 3种去除真皮中细胞成分的方法

  1.2.1 去垢剂法 去垢剂是一类可溶于水的脂类,它有亲水部分和疏水部分,能裂解脂膜,溶解抗原,清除免疫复合物。去垢剂分为: (1)离子型:带电荷头部(+或-),如十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠等;(2)非离子型:带非极性头部,如TritonX100、TritonX114、NP40、辛葡糖苷、Tween20等;(3)两性型:带有+和-电荷头部,如CHAPS、Zwitterget等。其中以TritonX100 应用最多,其在溶液中的稳定性高,不易受强电解质如无机盐等的影响,能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物;同时,TritonX100中的疏水端也能和膜蛋白结合而破坏生物膜,从而使细胞溶解。该法脱除细胞彻底,但同时对基底膜结构破坏大而不利于上皮细胞的黏附生长[1]。

  1.2.2 碱性化学试剂法 目前只有NaOH。NaOH销蚀法是通过其碱离子的吸水作用夺取组织细胞的水分,使细胞脱水而死亡,然后用超声清洗仪清洗除去。该法脱除细胞彻底且得到的胶原纤维结构完整、排列较正常松散,具有韧性好、易塑形、便于手术操作等特点。但脱水过程要注意控制NaOH的作用时间,若时间过长则会使胶原变性和蛋白裂解只能得到真皮皮浆[3]。

  1.2.3 生物酶法 采用胰蛋白酶、DispaseII、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等作为脱细胞剂,可根据不同组织和临床情况自由选择,一般联合使用不仅能缩短制作脱细胞基质时间,更能促进真皮基质的无细胞化、保留更多的基底膜和降低抗原性[2,4]。

  1.3 辅助制备的措施

  1.3.1 戊二醛交联法 用稀释的戊二醛溶液(体积分数为0.2%)预先交联皮肤标本5~10min,利用醛基封闭抗原位点作用降低ADM的免疫炎症反应,提高真皮的稳定性和改善机械性能,更有利于ADM的创面黏附及表皮细胞在ADM表面的再生[5]。

  1.3.2 打孔法 打孔是利用毛细现象使创面基底血浆等渗液渗透到脱细胞真皮基质表面以维持皮片早期的营养供应,传统的方法是采用皮肤拉网机在ADM上打孔,将其制作成孔径在500~800mm的网状薄片,但由于该法制成的网眼大且分布不均匀,以及自体韧厚皮片移植后远期仍存在一定程度上的皮片挛缩和网眼瘢痕。最近有学者利用激光打孔,使ADM的孔径达到数十到数百微米,克服了传统打孔的缺点,提高了创面修复的质量[6]。

  1.3.3 冷冻干燥处理法 ADM经冷冻干燥处理后,其抗原性下降、结构更疏松,易于宿主细胞长入和利于长期保存。

  2 ADM的作用机理

  ADM保留了真皮与表皮之间的基底膜,故在应用时可形成基底膜与真皮两个面。基底膜面支持移植于其表面的断层皮片的生长,对表皮细胞的分化成熟和移植皮的外观与功能起着非常重要的作用[7],亦有利于组织工程中种子细胞或培养的角朊细胞的黏附、扩展等。真皮面有利于ADM在宿主内快速血管化,为成纤维细胞的生长提供良好的支架,有助于对脱细胞真皮胶原成分的改建,促使成纤维细胞形成形态结构及排列分布正常的胶原纤维,还具有调节、诱导、促进宿主细胞长入,促进纤维细胞增生、新生血管和上皮形成等作用[8]。真皮成分的多寡是创面愈合后弹性、外观是否良好的重要因素,瘢痕形成的量及挛缩程度与所植皮片中真皮的含量成反比。真皮含量不足时成纤维细胞只能合成不成熟的基质,此种基质经改建后即成为瘢痕组织。ADM作为一种真皮代替物能被宿主接纳,并被改建成为自体真皮组织,减少皮片移植后的瘢痕形成及挛缩,能与全厚皮片移植后的效果相媲美[9]。

  3 ADM的免疫原性

  一般认为,皮肤移植时机体主要针对表皮细胞、真皮中的内皮细胞及成纤维细胞产生细胞免疫,而通过脱细胞工序后的ADM中非细胞成分的免疫原性极低。因此,ADM移植后宿主发生排斥反应和炎性反应的可能性不大。大量研究证实,异体ADM移植不存在临床可见的排斥反应,也未检测到组织器官毒性和细胞毒性[7]。但近几年有学者研究表明,除细胞外异种ADM的细胞外基质存在一定的免疫原性。Srivastva等[10]用DispaseⅡTriton X100分别制备猪和鼠的ADM并移植覆盖于鼠背部全层皮肤缺损区,同时在ADM表面覆盖自体刃厚皮片。术后1个月异种移植创面组织切片炎症反应强烈,并见少量的完整肥大细胞,表明肥大细胞脱颗粒反应已被激发。受体鼠血清对猪ADM匀浆的免疫反应呈强阳性,在真皮乳头和基底板处(Ⅳ型胶原和层粘蛋白)反应最强。而ADM的主要成分I型胶原和Ⅲ 型胶原与其抗血清不发生反应。姜笃银等[11]对异种脱细胞真皮基质的制备、抗原性、动物及临床试验等研究的结果与Srivastva一致,发现异种ADM移植物虽能被宿主接受,但移植后有比同种异体ADM更激烈的炎症免疫反应,如组织学异物巨细胞反应,甚至出现严重的迟发性排斥反应。推测异种ADM天然胶原分子的羧基末端和氨基末端存在明显种属差异是异种ADM和同种异体ADM出现不同免疫反应的原因。

  4 ADM在整形外科的应用

  4.1 烧伤创面及烧伤后期瘢痕挛缩畸形的修复

  ADM最早应用于大面积烧伤切痂创面的修复上,发现其能有效地减少疤痕形成。Wainwright[7]应用脱去细胞成分的异体真皮与网状自体薄皮片复合移植修复深度烧伤创面,术后2周ADM被自体表皮完全覆盖,后期经组织学观察上皮细胞覆盖良好,较少发生疤痕增生。潘云川等[12]运用异体ADM与自体皮浆复合移植修复深度烧伤的早期切痂创面,术后复合移植皮肤大部分成活,质地良好,而单纯的皮浆移植后烧伤创面仍为瘢痕组织覆盖。黄智勇等[13]采用脱细胞真皮基质与刃厚皮形成复合皮片移植修复各关节烧伤后遗瘢痕松解切除后创面,术后随访0.5~2a。但应指出的是,虽然患者的移植皮片颜色与周围正常皮肤颜色接近、皮片柔软、瘢痕增生不明显及关节功能较术前显著改善,但烧伤创面的彻底清创与患者全身营养状况仍是移植皮肤成活的关键。

  4.2 慢性创面及病理性瘢痕的修复

  随着对ADM可提供足够的真皮组织含量的认识,许多学者将其应用到慢性创面、增生性性瘢痕及瘢痕疙瘩等的整形修复上。霍然等[14]对12例胸部疤痕疙瘩的患者一期应用ADM覆盖胸部疤痕疙瘩切除后的创面,二期应用自体刃厚皮片移植于ADM上,术后脱细胞真皮基质和刃厚皮片均大部分成活,无失败病例。11例获3个月~2a随访,胸部瘢痕疙瘩无复发,术区皮肤质地相当于中厚皮片。Gibbs等[15]将其应用到慢性创面、增生性瘢痕等的整形修复上,亦收到了与自体中厚或全厚皮片移植同样的修复效果。

  4.3 颌面部整形及美容

  4.3.1 腭裂修复 Clark等[16]采用标准两瓣术修复腭裂7例,用异体ADM即刻缝合于口腔粘膜深面行腭成形术并术后定期随访,结果:2例口腔腭部粘膜切口裂开致皮片暴露;2例在手术缝合鼻腔面粘膜时鼻腔粘膜撕裂;7例均无穿孔;7例均出现上皮化且与伤口融合,无局部炎症与感染,与周围组织相比均未见明显瘢痕挛缩。

  4.3.2 矫正鼻畸形 鼻畸形多由外伤、骨折等多种原因所致。Jackson等[17]对15例鼻脊不规则患者应用ADM实施了整形手术,经过2 a随访,所有患者的骨性畸形均得到良好的矫正。Gryskiewicz等[18]应用ADM对58例患者实施了鼻轮廓整形手术,经过追踪观察,1a后轮廓改善良好,相对稳定。

  4.3.3 眼睑、结膜层缺损的修复 眼睑部缺损的修复方法多种多样,常运用自体皮片、皮瓣或复合组织移植修复,但效果欠佳,且顾此失彼,造成新的畸形。Shorr等[19]运用ADM修复63例眼部各种畸形的患者,利用ADM修复睑板、结膜等的缺损,修复后移植物无排斥反应,且临床观察效果良好。陈家祺等[20]利用异体ADM代替睑板,运用眼睑原位重建术治疗10例眼睑缺损患者,随访观察平均8个月。结果显示,脱细胞真皮植入眼睑后炎性反应轻微,未见有植入物脱落和感染现象,受体结膜可在脱细胞真皮表面爬行生长。组织学检查发现术后0.5a脱细胞真皮植片内有新生毛细血管和纤维母细胞存在。ADM在眼部组织缺损方面的应用具有广阔的前景,但其临床远期效果还需进一步追踪。

  4.3.4 隆唇 Castor等[21]应用ADM联合自体脂肪行隆唇与单纯应用自体脂肪注射行隆唇对比,ADM红唇粘膜外露平均增加约61%,而对照组平均增加约13%;ADM唇部外翘增加1mm,随访3个月未发现明显吸收,对照组有约9%的吸收。Sclafani等[22]将微粉化的ADM注射到萎缩的唇部皮下来矫治老年性唇萎缩,术后观察发现使用微粉化ADM的患者在美学方面的效果优于使用戊二醛交联的胶原患者。

  4.4 其他

  Witt等[23]将ADM用于治疗1例大疱性表皮松解症男孩的假性并指获得了成功。杨勇等[24]应用ADM对8例复杂性膀胱阴道瘘患者进行了手术治疗。术后阴道漏尿停止,随访6~12个月未见复发,认为同种异体ADM替代自体组织修复,手术效果确切,尤其是避免了以往获取自体组织所带来的创伤。

  5 结语与展望

  脱细胞真皮基质在整形美容外科领域的应用范围不断扩大,且有明显的治疗效果,但作为一种新技术毕竟还有其不足的一面。如异种ADM的免疫反应较异体ADM强烈;移植后ADM在宿主体内的远期效果尚不明确及异体ADM的来源受限制等等。这些问题有待进一步研究。但笔者认为,ADM由于具有良好的生物相容性和完整的三维网状支架结构能为细胞或种子的定植、迁迂及生长等提供良好的环境。随着细胞学和生物组织工程的迅速发展,ADM将有可能被运用于组织工程学皮肤或其他软组织,为皮肤粘膜损伤的修复和其他软组织的重塑提供一条更有效的途径。

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