中国北方老年人和散发型阿尔茨海默病患者胆固醇酯转运蛋白基因L296Q突变的缺失

　　作者：陈大伟,张凡1,谢仁厚,李华军,陈彪　　作者单位：空军总医院干部病房神经内科,北京

　　【摘要】目的探讨胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因的一个新发多态位点——L296Q与散发型阿尔茨海默病(SAD)易感性的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)、变性高效液相色谱(DHPLC)和测序等方法检测107例SAD患者和115名健康老年人L296Q基因多态性。结果 无论是哪种方法均未发现SAD组和对照组存在Q 等位基因或LQ 和 QQ基因型。结论 在研究人群中未发现此多态位点，可能与研究人群间的种族、年龄差异或技术问题有关。

　　【关键词】 胆固醇酯转运蛋白,基因多态性,阿尔茨海默病,高密度脂蛋白

　　【Abstract】 Objective To investigate the association between CETP(L296Q) polymorphism and sporadic AD (SAD) in Northern HanChinese.Methods L296Q genotype was determined in 107 cases and 115 age and gendermatched controls by three methods such as polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP), denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and DNA sequencing. Results None of the AD and healthy subjects was carriers for this variant.Conclusions This difference from a previous study may be due to the differences in age and race, or a technical problem.

　　【Key words】 Cholesteryl ester transfer protein; Polymorphism; Alzheimer’s disease; Highdensity lipoprotein

　　散发型阿尔茨海默病(Sporadic Alzheimer disease，SAD)是老年人中最常见的痴呆类型，大量证据表明血浆和脑脊液(CSF)中低水平的高密度脂蛋白(HDL)是SAD的一个危险因素〔1～3〕。胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)是血浆一种糖蛋白，它能够把胆固醇酯从HDL转移到低密度脂蛋白(LDL)、中间密度脂蛋白(IDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)，并交换甘油三酯，从而在调节血浆HDL水平和重塑HDL颗粒组成方面发挥重要作用，高活性的CETP可以降低HDL水平〔4，5〕。一些研究发现，脑组织中的胶质细胞可以合成和分泌CETP，提示CETP在中枢神经系统的脂质转运和再分布中也发挥重要作用〔6〕。Arai等的流行病学调查和Matthijs 等对既往50多个研究的荟萃分析显示CETP的某些多态位点可以影响CETP活性和HDL水平〔7，8〕，因此它是影响AD易患性的一个候选基因。前期研究发现CETP的D442G突变可能是国人AD的独立保护性因素〔9〕。最近，我国的郑克勤等在中国西部人群中发现一个新的CETP多态位点L296Q，位于第10位外显子的第8个碱基(T/A)，与冠心病相关〔10〕，本文主要探讨此多态位点与AD易感性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 107例SAD患者来自1998至2000年首都医科大学宣武医院神经内科门诊(41例)和2000年北京城乡老龄纵向研究社区人群(66例)。应用简易精神状态检查(MMSE)、长谷川痴呆量表(HDSR)、日常生活能力量表(ADL)初筛有痴呆、Hachinski缺血指数<4分的患者，采用美国国立神经病、语言功能紊乱和脑梗死研究所及AD和相关疾病协会(ADRDANINCDS)临床诊断标准，把诊断为“可能性”的患者列为研究对象，全部患者无阳性家族史。健康对照组来自同一社区人群，均为健康老年人。SAD组107例中男53例，女54例，年龄65～88〔平均(75.7±9.1)〕岁，MMSE平均得分为(15.3±5.9)分。健康对照组共有115名，男45名，女70名，年龄70～85〔平均(77.8±5.8)〕岁，MMSE平均得分为(23.1±4.0)分。SAD组与健康对照组的性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 DNA的提取 常规酚抽提法提取外周血DNA。

　　1.2.2 聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)检测 L296Q的PCR引物设计应用Oligo 6.0软件(Molecular Biology Insights,美国)，正向和反向引物分别为5′CACCCTCCAACTTCCTCATTTCTTTTCAGGCACTG3′和 5′TAAGTGCTTCACTCCATGCCGAACAACCGAGTAGG3′;划线、斜体的碱基为错配以形成Pst I酶切位点。PCR反应：首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环，最后72℃再延伸10 mim，并4℃保存。PCR的产物为239个碱基长度的片段，在37℃条件下被Pst I酶切8 h，用3%的琼脂糖电泳和溴化乙啶(EB)染色5 min后，在紫外灯下鉴定扩增产物，Q 等位基因酶切为2个片段(202 bp和37 bp)，而L等位基因不能被酶切。

　　1.2.3 变性高效液相色谱(DHPLC)和测序检测 按原则设计一对PCR引物，5′TTGGTCCCTGCGAAGTTT3′ 和5′CAGCCTTGCCATTCACTAAGTT3′，扩增的383 bp碱基长度的DNA片段作为DHPLC和测序的目标片段。PCR条件：首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃再延伸10 mim，并4℃保存。由美国Transgenomic公司生产的3500HT DHPLC仪对产物进行DHPLC检测，根据WaveMaker软件和预试验，确定L296Q的融解温度为61℃。每3个待检验样本随机组合成一个DNA Pooling，经过高温变性，缓慢退火后检测。若混合后的样本经DHPLC检测为单峰，则代表纯合基因型，双峰代表杂合基因型。从每种峰型的样本中随机选出几个测序，然后用测序证实的野生型样本的PCR产物与等量的单峰样品混合进行WAVE变性，再进行DHPLC。如果仍为单峰，说明被检测样品基因型为纯合野生型，如果为双峰，说明为纯合突变型。

　　2 结 果

　　无论RFLP方法还是DHPLC和测序方法均未发现SAD组和对照组有Q等位基因或LQ 和 QQ基因型。

　　3 讨 论

　　体内和体外实验均证明细胞内高胆固醇可以促进β淀粉样蛋白(Aβ)的产生，后者被认为是AD病理的核心部分〔11〕。HDL是脑内惟一的脂蛋白并在转移和清除脑内过多胆固醇方面发挥重要作用〔1〕。HDL还能与Aβ直接作用而阻止其聚集形成淀粉斑〔12〕。以上研究表明脑内高水平HDL可以对AD的发生起到保护的作用，大的流行病学调查和荟萃分析均显示与HDL代谢相关的CETP基因的某些功能多态位点可以影响CETP的活性和HDL的水平〔7，8〕，所以CETP是研究AD易感性的一个合理的候选基因。

　　张克勤等在中国西部人群中首先发现一个新的CETP多态位点L296Q，它位于CETP的第10位外显子，报道Q等位基因的频率在对照组为9.1%，而在冠心病组为16%，其差异存在统计学意义，因此他们认为这个多态位点的Q等位基因与冠心病的发生有关〔10〕，提示该位点是CETP的一个功能性位点。本文假设该位点与SAD具有相关性，然而通过PCRRFLP、DHPLC和测序的方法并没有在本研究队列中发现这个多态位点，仅探测到L等位基因。张克勤的研究显示Q等位基因的携带者可达人群的17.7%，这个频率足以保障在本文的222例的样本中探测到Q等位基因，但本文研究结果与该研究存在差异，原因可能为：①种族差异，该研究中并未指出所检测的中国西部人群的种族，而本文研究对象主要为北方汉族人群，因此推测可能种族上存在差异;②年龄差别，本研究对象的平均年龄为75岁，明显高于该研究(55岁左右)，一些研究表明与长寿相关的基因多态位点在老年人中的频率明显高于成年人，而与老化相关疾病密切联系的多态位点则与之相反，在老年人中的频率会变低〔13〕。所以猜测与冠心病相关的Q等位基因在老化人群中变得频率减低，甚至消失;③技术问题，后来的研究不能证实已报道过的多态位点并不是史无前例，单核苷酸多态性(SNP)数据库中的许多多态位点无法在后来的研究中得到验证，这些SNP中多数是通过测序方法被发现，早先发现的HSL两个多态位点后来被无法证实而撤回的例子足以说明这一问题〔14〕，Tahvanainen 和 Palmen也遇到相似情况，因此本文赞同Palmen的观点：一个多态位点的确定至少要经过2种以上的方法验证〔15〕。无论怎样，CETP基因仍是影响AD易感性的一个合理候选基因，今后仍需对其他位点进行研究。

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