表皮细胞生长因子在体诱导猪骨髓间充质干细胞向皮肤组织分化作用的研究

　　作者：都义日，付小兵，李存保，孙同柱，方利君(解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室，北京 100037;内蒙古医学院基础部，呼和浩特 010059)

　　摘要： 目的 观察表皮细胞生长因子(EGF)在体内是否具有诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向皮肤组织分化的作用，及其在皮肤创面愈合中的作用。方法 抽取小型猪骨髓，体外分离、纯化和培养MSCs，并用5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)进行标记。6只小型猪共48个创面，随机分为EGF+MSCs治疗组(A组)、MSCs治疗组(B组)、EGF治疗组(C组)和生理盐水对照组(D组)。观察伤后治疗3、7、14、21及84天的创面，并用病理学、免疫组化方法对创面的修复质量进行评估。结果 A组的皮肤创面愈合速度明显快于其它治疗组，并且在皮肤愈合的组织病理等级评分上优于B、C和D组。A组表皮层BrdU和CKp双染阳性细胞比B组更为多见。结论 EGF具有在体促进猪骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化，加快皮肤创面愈合速度和提高愈合质量的作用。

　　关键词：表皮细胞生长因子;骨髓间充质干细胞;皮肤创面

　　In vivo studies on the differentiation of mesenchymal stem cells to skin tissues induced by epidermal growth factor

　　DU Yiri,FU Xiaobing,LI Cunbao,et al.

　　(Key Laboratory of Wound Repair,304 Medical Department,The General Hospital,PLA,Beijing 100037,China)

　　Abstract： Objective To investigate the role of epidermal growth factor (EGF) on the differentiation of mesenchymal stem cells to skin tissues in vivo and its effect on skin wound healing.Methods MSCs was isolated from porcine marrow,then purified and cultured with 5bromodeoxyuridine(5-BrdU) as a label in vitro.Fortyeight skin wounds on the 6 pigs were divided into EGF+MSCs (A),MSCs(B),EGF(C) and contrast (D) groups randomly and treated correspondingly.Wound closing index (WCI),cell morphology and histological changes in the defected regions were evaluated 3、7、14、21、84 days after treatment.Results Curative speed of defected regions of group A was faster than that of the other groups;Hierarchical scores of histopathology on the specimens of group A was also higher than that of the other groups.The dualpositive stained cells by BrdU and CKp were more in the specimen of the group A than that of group B.Conclusion EGF can induce MSCs to differentiate into epidermal cells,and promote the repair of skin wounds as well.

　　Key words：epidermal growth factor;marrow mesenchymal stem cells;skin wound

　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，在不同诱导条件下可以向不同的组织分化。体外实验表明，经分离培养的MSCs在EGF、成纤维细胞生长因子、维生素C、转化生长因子β的诱导下，可向皮肤组织分化。本实验对小型猪全层皮肤缺损创面给予不同的治疗方法，观察皮肤创面愈合的情况，以及不同治疗方法促进创面修复的效应及其可能的作用机制。

　　材料与方法

　　1 自小型猪髂骨抽取骨髓

　　无菌条件下加入F12培养基(购自美国Hyclone公司)，并将其加入到密度为1.077kg/m3的Ficoll 分离液中(购自美国Parmacia)，1500r/min离心30分钟，吸取单核细胞层。洗涤细胞2次，并用F12培养液(10%胎牛血清，100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素)重悬，按1×106/ml密度接种并置于37°、5%CO2饱和湿度的孵箱内培养。MSCs回植前48小时，用含有5μmol/L溴脱氧尿嘧啶(购自美国Sigma公司)进行标记，备用[1-3]。

　　2 动物分组

　　小型猪6只，体重15～20kg。实验前禁食12小时，麻醉、背部剃毛，常规消毒后，在背部脊柱两侧2.0cm处由前至后，各制备面积为2.54cm2的圆形创面，深至皮下。将创面随机分为EGF+MSCs治疗组(A组)、MSCs治疗组(B组)、EGF治疗组(C组)和生理盐水对照组(D组)四组。治疗用MSCs以纤维蛋白胶(购自广州生物制品公司)为载体，以1×106/ml直接单层涂布到创面。EGF的用量为50单位/cm2(以上各组用量均为0.5ml/创面)。

　　3 评价指标

　　(1)大体观察：用透明膜描记法观察创面面积。计算创面闭合指数(WCI)WCI=(1-处理后创面面积/原始创面面积)×100%;(2)组织病理学检查：在伤后 3、7、14、21、84天取皮肤创面组织，用10%的甲醛固定后，脱水、石蜡包埋，进行苏木素-伊红(HE)染色。对创面愈合的组织病理结构进行评价(见表1)。

　　表1 皮肤创面愈合的组织病理结构评价(略)

　　4 免疫组化双染法

　　(1)免疫组化双染法检测BrdU和CKp两种抗体，双染试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。兔抗广谱角蛋白多克隆抗体(CKp，购自美国Maixin公司)工作浓度1:100，CKp阳性细胞显示红色胞浆;鼠抗BrdU单克隆抗体(购自美国Sigma)工作浓度1:1000，BrdU阳性细胞显示兰黑色胞核。以非特异血清代替一抗作为对照。

　　5 统计学处理

　　结果用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料的组间比较选用方差分析，组内比较选用NewmanStudentKeul检验，P<0.05和P<0.01为有统计学意义。

　　结果

　　1 创面面积

　　见图1和表2，伤后21天时，A组创面闭合指数较B、C和D组均明显升高(P<0.01)。B组和C组的WCI相互间差异不明显，但均显著高于对照组。

　　2 HE染色下创面愈合情况的定性评价

　　治疗后第3、7天组间创面愈合的组织病理等级评分差异无显著性。第14、21天的组织病理结构等级评分结果见表3、4，A组与其它组比较差异显著，见图2、3。

　　84天的真皮层组织病理评价组间比较，差异有显著性。

　　3 MSCs向表皮细胞分化的变化规律

　　免疫组化双染结果显示，在A组伤后3、7、14、21天的切片中均可见双染阳性细胞，提示这些既有BrdU阳性(兰黑色胞核)同时CKp阳性(红色胞浆)的双染阳性细胞可能是由MSCs转化而来的表皮细胞(图4)。B组仅可见少量的双染阳性细胞，其数较A组少。D组未见BrdU或双染阳性细胞，只有CKp阳性细胞，即为自身修复的结果。

　　图1 不同处理组间创面闭合指数(略)

　　图2 伤后21天MSCs+EGF治疗组新生表皮层较厚，分层明显 HE ×200 (略)

　　图3 伤后21天对照组新生表皮层较薄，分层不明显 HE ×200(略)

　　图4 BrdU和CKp免疫组化双染 ×200(略)

　　表2 不同处理组间创面闭合指数(略)

　　如表所示，方差分析结果显示P<0.05，组间比较：A与B或C组间WCI的差异有统计学意义(P<0.05)。B与C组间差异无显著性。各治疗组WCI高于D组。

　　表3 伤后14天皮肤创面愈合的组织病理结构评价(略)

　　A组与B组比较：*P<0.05

　　表4 伤后21天创面愈合的组织病理结构评价(略)

　　A组与B组比较：*P<0.05

　　标注：(1)“+”见表1;(2)表中数字：不同时间、不同治疗组选取组织结构完整的20张切片，依照表1的标准对切片进行评价。表中数字代表符合每种评分等级的阳性切片数。

　　讨论

　　MSCs[4-6]作为皮肤创伤修复组织工程的种子细胞，具有取材容易，对机体损伤小;体外扩增能力强，能定向分化;易于基因操作;组织相容性好等优点，用于自体细胞移植的个体化治疗具有不可比拟的潜在临床应用前景。

　　MSCs在不同诱导条件下，可向不同的组织细胞分化。付小兵等[2]实验表明，以BrdU标记的MSCs细胞直接接种到创面皮肤组织中，经过一段时间的观察，在愈合的创面皮肤中找到了有BrdU标记的MSCs，这些细胞多聚集在真皮层及皮下脂肪层的血管周围，表达血管特异性Ⅷ因子;有少量的BrdU阳性细胞存在于表皮层，并能够表达角蛋白，充分说明了MSCs可以向表皮及血管组织的转化。

　　在促进MSCs向皮肤组织分化的生长因子中，EGF发挥着重要作用，它是表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。EGF[7]具有促进皮肤表皮细胞，成纤维细胞和内皮细胞等生长增殖作用。体外实验也证明，MSCs在EGF等生长因子的作用下，可以向皮肤组织分化，但尚无将它们共同作用于创面的体内实验研究的报告。

　　本实验将MSCs与EGF共同作用于创面，结果表明A组的创面愈合速度明显快于其它治疗组和对照组;其表皮层厚且角化和分层明显;基底细胞层呈柱状、单层排列。实验通过对BrdU和CKp的免疫组化双染显示，A组的双染阳性细胞数于B组比较明显增多。以上结果提示，EGF与MSCs共同作用时更有利于MSCs向表皮细胞分化，并加速创面愈合速度和提高愈合质量。

　　目前MSCs的分化机制和诱导条件尚不清楚，多认为与干细胞所处的微环境密切相关。本实验通过将MSCs与EGF共同作用于创面以寻求更好的促进创面愈合的方法。然而EGF与MSCs之间是如何作用的机制仍有待于进一步研究。如果其机制得到阐明，将会对皮肤创面愈合提供新思路，为今后的临床治疗提供新的治疗策略。

　　参考文献：

　　[1]方利君,付小兵,孙同柱，等.骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究[J].中华烧伤杂志,2003,19(1):22-24.

　　[2]方利君，付小兵，孙同柱，等.在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步研究[J].中华创伤杂志，2003,19(4):212-214.

　　[3]方利君，付小兵，孙同柱，等.猪骨髓间充质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定[J].中国危重病急救医学，2003，10(15)：606-608.

　　[4]Minguell JJ,Erices A,Conget P.Mesenchymal stem cells[J].Exp Biol Med(Maywood)，2001，226(6):507-520.

　　[5]Strauer BE,Brehm M,Zeus T.Intracoronary,human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction[J].Dtsch Med Wochenschr，2001，126(34-35):932-938.

　　[6]Caplan AI,Bruder SP.Mesenchymal stem cells:building blocks for molecular medicine in the 21st century[J].Trends Mol Med，2001，7(6):259-264.

　　[7]付小兵，孙同柱，王亚平.表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进创面修复效应的比较性研究[J].中国修复重建外科杂志，1999，13(5)：278-282.

　　基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目(G1999054204)

　　国家自然科学基金面上项目(30170966)

　　国家自然科学基金重点项目(30230370)