感觉神经肽P物质在糖尿病大鼠皮肤损伤修复中的应用

　　作者：郭文治，赖西南，王正国，刘育杰，王丽丽 作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤、烧伤与复合伤重点实验室，重庆 400042

　　【摘要】目的 观察外源性感觉神经肽P物质(SP)在糖尿病大鼠皮肤伤口愈合中的作用。方法 链脲佐菌素(STZ)致糖尿病大鼠48只，行鼠背部脊柱两侧皮肤切割伤口后，随机分为实验组与对照组，每组24只。实验组伤后在伤口四周注射10-7mol/L的SP，每日2次，每个伤口200μl/次，连续注射4天;对照组注射等量SP溶剂生理盐水。伤后4、7、10、14、17、21天用透明膜描记法记录伤口愈合面积，伤后 4、7、10天取材检测肉芽组织羟脯氨酸总量和Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量。结果 实验组在伤后4、7、10、14天伤口愈合面积明显高于对照组(P<0.01)，愈合时间比对照组缩短1周;伤后4、7、10天肉芽组织中羟脯氨酸含量、Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显高于对照组(P<0.01)。结论 应用外源性SP明显促进糖尿病大鼠皮肤创伤愈合。

　　【关键词】 感觉神经肽P物质 糖尿病 皮肤 伤口愈合

　　Application of exogenous substance P in wound healing of skin injury in diabetic rat

　　GUO Wenzhi，LAI Xinan，WANG Zhenggou，et al.

　　State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Institute of Surgery Research,Daping Hosptial，Third Military Medical University,Chongqing 400042，China

　　Abstract： Objective To study the effects of substance P(SP) on improving the wound healing of skin injury in diabetic rat.Methods Fortyeight diabetic rats,each rat had two roundshapedwounds through the whole skin by the side of the spine on the back.The rats were divided into two groups: control group and experimental group,each group consisted of 24 rats.200μl of substance P,10-7each wound,was injected around each wound of the experimental group,two times a day.While the same volume of normal saline was injected in the same site to the control group.The area of the wounds was measured at different time.The content of hydroxyproline was measured at the same time.The changes of the collagen type I and collagen Ⅲ were estimated by immunohistochemical staining.The healing time was recorded after wounding.Results The wound area decreased obviously in the experimental group as compared with control group on the 4th,7th,10th,14th day after injury(P<0.01).The healing time shortened in the experimental group as compared with the control group.The content of hydroxyproline within granulation tissue increased on the 4th,7th,10th day.The same changes with the collagen type Ⅰ and collagen Ⅲ(P<0.01) were found.Conclusion The healing of the wound on the back of diabetic rat was improved by substance P.

　　Key words:substance P;diabetes;skin;wound healing

　　感觉神经肽P物质(substance P，SP)为11个氨基酸的直链多肽，属速激肽家族，广泛分布于周围和中枢神经系统中,巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞也可合成。皮肤损伤时，感觉神经末梢释放的SP启动神经源性炎性反应，促进细胞增殖，参与皮肤修复调控[1]。以往的实验已证实，糖尿病皮肤感觉神经纤维发生病理改变，皮肤SP含量降低[2]，但尚不知糖尿病皮肤损伤如适时补充外源性SP对促进损伤修复的作用。本实验采用链脲佐菌素致糖尿病大鼠，在皮肤全层切割伤修复的早期阶段应用外源性SP，观察对伤口愈合的影响，为SP合理有效的临床应用提供实验依据。

　　材料与方法

　　1 材料

　　1.1 实验动物

　　70只2～3个月龄清洁级SD大鼠 (第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)，体重180～220g。大鼠经适应性饲养后72小时用于本实验。

　　1.2 主要试剂

　　SP和链脲佐菌素(STZ)均由美国Sigma公司生产;羟脯氨酸测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产;Ⅰ型和Ⅲ型胶原抗体由武汉博士德生物工程有限公司生产。

　　2 实验方法

　　2.1 动物模型的建立

　　STZ注射制备糖尿病大鼠模型：70只大鼠禁食24小时，实验当日测定每只体重，收集尿液和尾静脉采血，在分别测定尿糖和基础血糖值后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg，1周后定期检测空腹血糖和尿糖值。血糖>16.5mmol/L，尿糖(+++～++++)为糖尿病大鼠模型。模型制备成功50只，血糖在16.5～30.1mmol/L之间，平均22.1mmol/L。淘汰20只，其中因衰竭死亡12只，血糖未达标8只。

　　2.2 糖尿病大鼠皮肤全层切割伤模型制作

　　随机取血糖稳定的糖尿病大鼠模型48只，随机分为实验组、对照组，每组各24只，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后消毒背部皮肤，用自制打孔器在脊柱两侧切直径1cm的皮肤全层圆形伤口。损伤后4、7、10、14、17、21天每个时间点每组4只大鼠，即8个伤口。

　　2.3 SP局部应用

　　实验组在致伤后的4天，每日分2次在皮肤伤缘与伤口中央注射SP(10-7mol/L)200μl;对照组皮肤伤缘与伤口中央注射等量的SP溶剂生理盐水，注射后无菌包扎伤口。鼠自由饮水、摄食，分笼饲养。两组检测指标相同。

　　2.4 观察指标及评价方法

　　(1)分别于伤后4、7、10、14、17、21天用透明膜描记法记录伤口面积大小。所得资料用计算机图像处理软件ImagePro Plus结合Excel2000按照以下公式计算伤口愈合面积百分比：(初始面积-残留面积)/初始面积×100%。(2)记录创面完全愈合时间。每天肉眼观察创面愈合情况，其完全愈合标准为：伤口完全闭合;上皮覆盖;伤口表面光滑;色均一;无残余缺损。(3)伤后不同时间活杀大鼠，切取伤口组织。以比色法测定组织中羟脯氨酸含量，间接推算组织中胶原含量(羟脯氨酸在胶原中占13.4%);以4%多聚甲醛固定切取组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察显微结构改变;以免疫组化方法显示伤后愈合组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积量，阳性染色判定为细胞外基质出现的线状、网状的棕黄色反应物，其染色强度高于背景非特异染色。每例标本取3张切片，每张病理切片取5处，在40×10的高倍镜下，利用MIG2000综合图像分析系统计算高倍镜下阳性染色面积比值(阳性染色面积与1个视野总面积之比)，取平均数作为该例的测量值。

　　3 采用统计学分析

　　Microsoft Excel 2000软件处理，以均数±标准差(±s)表示所有数值，两组间比较采用Student's t检验。

　　结 果

　　1 组织学变化及愈合面积与时间

　　实验组注射SP的伤缘皮肤明显水肿，伤后4天伤口肉芽组织有大量炎细胞浸润，炎性反应程度明显重于对照组;伤后7天实验组炎细胞浸润减轻，成纤维细胞、内皮细胞增殖明显，伤后10天上皮已覆盖大部分伤口，伤后14天完全愈合。对照组伤后4天肉芽组织内炎细胞浸润少，伤后7天成纤维细胞、内皮细胞数少，伤后21天完全愈合。伤后17天内实验组伤口面积百分比均明显高于对照组(表1)。表1 伤后不同时间伤口愈合面积百分(略)

　　2 胶原含量及组织学变化

　　如表2所示，伤后实验组和对照组肉芽组织中羟脯氨酸含量均增加，伤后10天达到峰值;实验组肉芽组织中羟脯氨酸含量明显高于对照组。表2 伤后不同时间肉芽组织中羟脯氨酸含量变化(略)

　　如表3及图1～4所示，伤后各时相点实验组Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化染色强度均较对照组强，各时相点阳性面积比值均高于对照组。表3 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化半定量分析结果(略)

　　讨 论

　　目前认为糖尿病患者皮肤损伤后愈合困难的原因可能和异常炎症反应所致的愈合过程紊乱、局部高血糖环境与糖基化终末产物蓄积、内源性生长因子缺乏或受体活性下调、微血管损伤以及神经营养障碍等众多因素有关[3]。本实验采用已广泛应用于糖尿病难愈伤口研究的STZ糖尿病大鼠模型[4]，发现糖尿病皮肤损伤早期伤口局部应用外源性SP，肉芽组织羟脯氨酸含量增高，Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫染色阳性面积比值增加，愈合时间可较未应用者缩短1周，提示糖尿病皮肤SP代谢与愈合明显有关。

　　皮肤SP主要来源于感觉神经纤维，以及巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞，成纤维细胞、内皮细胞不仅有特异性SP受体，也可合成SP，存在自分泌现象。皮肤创伤时感觉神经纤维释放的SP不仅发挥炎性介质的作用，诱导神经源性炎性反应，导致血管渗出增加、巨噬细胞趋化和肥大细胞脱颗粒，促进巨噬细胞、成纤维细胞等合成表皮生长因子、转化成生长因子β、成纤维细胞生长因子及受体，以及直接促进血管内皮细胞、成纤维细胞增殖，同时可诱导成纤维细胞、内皮细胞SP表达，“放大”感觉神经促细胞增殖的作用[5]。

　　以往的实验表明，正常皮肤组织损伤后，局部应用外源性SP，虽然有促进细胞及组织增殖作用，但效果并不十分显著。这可能与正常皮肤组织SP的局部代谢有关。由于糖尿病患者皮肤感觉神经纤维变性，神经纤维数目减少，且降解P物质的特异性基质金属蛋白酶表达的上调水平升高，因而糖尿病患者皮肤SP含量低[6]。糖尿病患者皮肤损伤时，神经纤维损伤变性加剧，微循环障碍，局部缺氧，SP含量可能进一步减少，炎症反应减弱，损伤修复延迟。外源性应用SP补充了糖尿病微环境下神经肽相对缺乏的状态，补充的SP直接与效应细胞如成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、角质形成细胞及血管内皮细胞等结合，一方面可以促进此类细胞的增殖、迁移、分化[7]，另一方面可以促进角质形成细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等分泌内源性的P物质及其它生长因子，从而形成细胞增殖分化的正反馈机制，增强了神经源性炎性反应，促进损伤皮肤修复，为糖尿病皮肤损伤的救治提供了新的思路。由于糖尿病是全身糖代谢紊乱导致的疾患，损伤皮肤SP代谢紊乱诱因复杂，而且局部应用的SP半衰期仅数十分钟，产生的炎症反应可能会产生疼痛等不适感，因此有必要继续探讨在纠正全身糖代谢紊乱的基础上，开展P物质应用的时机、缓释剂型等研究，最终达到SP在临床应用的目的。

　　【参考文献】

　　[1]蒋伟，王正国，赖西南，等.感觉神经肽SP在伤口愈合细胞因子网络调控中的作用[J].创伤外科杂志，2002，4(4)：250-252.

　　[2]郭文治，赖西南，刘育杰，等.糖尿病大鼠皮肤中神经肽P物质与皮肤病理学的相关性研究[J].第三军医大学学报,2005，27(9)：864-867.

　　[3]Stevens MJ,Feldman EL,Greene DA.The aetiology of diabetic neuropathy: the combined roles of metabolic and vascular defects[J].Diabet Med，1995，12(7)：566-579.

　　[4]Komesu MC,TangeMB,Buttons KR,et al.Effects of acute diabetes on rat cutaneous wound healing[J].Pathophysiology,2004，11(2)：63-67.

　　[5]赖西南，王正国，魏立，等.感觉神经肽P物质对肉芽组织成纤维细胞表达EGF、FGF2及受体的调控作用[J].中华医学杂志，2003，83(16)：1433-1436.

　　[6]Gibran NS,Jang YC,Isik FF,et al.Diminished neuropeptide levels contribute to the impaired cutaneous healing response associated with diabdtes mellitus[J].Surg Res，2002，108(1):122-128.

　　[7]Kemeny L，Von Restoff B.Specific binding and lack of growthpromoting activity of substance P in cultured human keratinocytes[J].Invest Dermatol，1994，10(3)：605.