人表皮干细胞在烧伤整形外科的研究进展

　　作者：高华伟 综述，郭力 审校    作者单位：（泸州医学院附属医院整形烧伤科，四川 泸州 646000）

　　【关键词】  烧伤整形；人表皮干细胞

　　皮肤是人体最大的组织器官，覆盖于人体的外表，是烧伤整形外科研究的主要内容。在烧伤方面，表皮干细胞(Epidermal stem cel1，ＥＳＣ)拥有无可质疑的潜能，它是皮肤组织特异性干细胞，在维持表皮自我更新、保持皮肤正常的表皮结构与功能方面起着重要作用．目前利用干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向，本文就对表皮干细胞的研究进展进行综述。

　　1  ESC的定义及定位    　　干细胞即起源细胞，是指尚未发育成熟的细胞，具有多分化潜能和自我更新和自我复制的功能，在特定条件下可以分化为不同的组织和器官，在基因调控下可以按照发育途径分裂产生分化细胞，也可以说干细胞充当了分化细胞“预备队”。    　　ESC终身保持有增殖能力，是可以增殖分化为各种表皮细胞的干细胞。对表皮细胞培养的研究发现，根据其生长潜力可将其分为3类：(1)完全克隆(holoclone)细胞，即干细胞(stem cel1)，或是标记储留细胞(1abel retaining cell，LRC)，具有强大的生长增殖潜力；(2)间生态克隆(paraclone)，即暂时扩充细胞(transit ampli- fying cell，基底层)；(3)终末分化细胞—鳞状细胞。人表皮基底层细胞中仅有1％-10%为ESC，且随着年龄的增大，ESC的数目随之而减少［１，２］。    　　ESC有干细胞共同特性：（1）慢周期性：表现为体细胞标记滞留。由于大部分的ESC处于静息状态，分裂缓慢，只有部分干细胞脱离干细胞群落进入分化周期，在新生动物细胞分裂活跃时掺入氚标记的胸腺，因而可长期探测到ESC的放射活性。（2）增殖潜能：表现为体外培养时细胞呈克隆生长，ESC可进行140次分裂，产生１×１０４０个子代细胞。ESC通过不对称或高度调空的对称分裂机制在体外可以分化成为表皮各种细胞，以维持的表皮的终身自我更新。 此外，ESC还有一个自身显著特点就是其对基底的黏附特性，主要是通过整合素实现的。ESC胎儿期主要集中在初级表皮嵴，成人时呈片状分布在表皮的基底层；在组织结构中位置也相对稳定，一般位于毛囊隆突部，即皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘［3］。在没有毛发的部位如手掌、脚掌，ESC位于与真皮乳头顶部相连的基底层；而对于有毛发的皮肤，ESC位于则位于表皮脚的基底层［４］。不同部位ESC的数量也存在差异，陈晓东等人就发现正常人头顶部、阴阜、阴囊皮肤组织中的ESC多于其他部位［５］。

　　2  ESC的标记物与鉴别    　　由于干细胞的慢性周期性，可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息ESC，如小鼠的ESC标记滞留可达2年；干细胞在体外培养表现出无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而可识别离体的ESC。目前ESC鉴别尚无十分精确的方法，只是利用其某些相对特异性找到了一些标记物。（1）整合素：整合素是一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，主要参与介导细胞与细胞外基质的黏附。整合素包括α、β两种亚基，目前认为β1整合素是较好的ESC的标记物。它在ESC和TAC表面高表达,，而终末分化细胞不表达但，因而目前用β1整合素来区分ESC、TAC与有丝分裂细胞及终末分化细胞。TAC在人的毛囊中存在着大量干细胞的外根鞘部位也有高水平表达的β1整合素。干细胞相对于TAC处于静止状态，因而能在表皮基底层聚集，有研究证明对人的表皮进行的标记实验显示在表皮基底层细胞的表面上部散布着β1整合素，大多数的β1整合素位于基底细胞周围形成“O”型环［６］。而且，在培养的以及人体内的表皮细胞中都有着丰富的高水平表达β1整合素的干细胞［７］。所以β1整合素对ESC的鉴别特异性程度不高。（2）角蛋白：角蛋白是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而可用于鉴别ESC、TAC及终末细胞。Ｋ19和Ｋ15被认为是ESC的阳性标志，TAC表达Ｋ5Ｋ14，而分化的终末细胞表达Ｋ1 和Ｋ10。毛囊隆突部干细胞及胎儿、新生儿表皮基底层ESC均表达Ｋ19。成人无毛囊皮肤如手掌、脚掌等部位基底层的ESCＫ19表达阳性，而有毛发皮肤基底层中ESC的Ｋ19则表达阴性。此外，毛囊隆突部ESC表达Ｋ15［8］，在干细胞分化过程中，Ｋ15表达减少较比19更早，故Ｋ15阴性而Ｋ19阳性可能是早期的TAC，Ｋ15阳性可能在鉴别毛囊隆突部ESC具有重大意义［9］。（3）P63转录因子：P63可识别角朊细胞中的干细胞,它是P63转录因子家族的成员之一，是成人皮肤基底角质形成细胞活动性增生能力的一个标志。P63转录因子在ESC中高表达，而在TAC中表达显著下降。这表明P63有可能是ESC特异性的表面标志物。ESC还有其它标记物：表皮细胞表面转铁蛋白受体（CD71）、CD90、CD98和CD200等，但现有特异性的标记物少，鉴别方法有限，但是相信随着科研的深入，特异性的鉴别方法会不断增加。

　　3  ESC的增殖、分化与调控    　　表皮组织的自我更新和损伤修复主要靠ESC的代偿性增殖和定向分化来完成［１１］。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响，内在因素包括结构蛋白，特别是细胞骨架成分调控细胞的不对成分裂；核因子的调控基因表达；干细胞与非干细胞及子代细胞的染色体修饰及生物种等。外在因素是指干细胞所处的外部微环境，称为干细胞壁龛，即众多的细胞因子。目前对ESC的增殖、分化与调控较多的研究集中在以下几点：（1）整合素-丝裂原激活蛋白激酶通路：整合素家族在表决皮干细胞的增殖分化过程中起着非常重要的作用，它们可能是干细胞自我分化和分化之间的平衡调节的重要因素之一，不但参与细胞与细胞外基质的黏附，还影响细胞的增殖、分化及凋亡等过程。（2）Notch信号转导通路：ESC表面的一种跨膜蛋白Ｄelta,与细胞表面的Ｎorth受体结合后可以调节干细胞，在正常机体，表皮全层均有Notch受体表达，Dehala配体则集中分布在基底层，尤其是整合素β1阳性细胞聚集处，表明是参与维持干细胞蔟的体积中起到重要要作用。（3）Wnt信号通路：在Wnt信号转导通路的成员中β-连环蛋白处于中心地位，它是在Wnt信号转导通路中其非常重要的下游作用因子，它不仅介导了细胞与细胞之间的黏附，还作为Wnt信号转导通路中的关键成员起着信号调节开关的作用。研究证明高度激活β-连环蛋白可导致ESC向毛发分化，而缺少时则促进其分化为脂腺细胞或角质形成细胞［１２］。（4）C-Myc: C-Myc 原癌基因也参与了ESC的分化调节,具有刺激细胞增殖、分化、诱导细胞凋亡及导致新生物形成等作用。近年的研究表明，C-Myc是β-连环蛋白的下游靶位，且两者可能存在自动反馈调机制。对于ESC，C-Myc的过度表达并未引起细胞的增殖分化及凋亡；相反在β-连环蛋白过度表达时，激活C-Myc可促使干细胞向TAC分化，并使其对基底膜脱黏附。下调C-Myc表达是细胞向终末分化的先决条件，因此，目前认为它是属于ESC的分化启动基因［１３］。（5）细胞因子：在ESC龛中，细胞因子是通过旁分泌和自分泌的方式调控作用的。目前研究已经证明，成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、角质形成细胞因子(KGF)，如EGF受体在表皮层才能检出，并随着胚龄延展而表达增多，表明了EGF肯定参与了调控ESC的增殖分化与迁移。（6）端粒酶：目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因，而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。有实验报道，胚胎、少儿、成人皮肤来源的ESC均有端粒酶反转录酶表达，其表达强度依次减弱，提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持ESC在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义［14］。（7）p63转录因子：P63转录因子可能在表皮干细胞的增殖分化调控上起重要作用。其子对表皮的发生和肢体的发育具有明显影响。实验发现，缺P63转录因子小鼠的皮肤表面只能观察到单层扁平细胞层，无棘细胞层、颗粒细胞层和复层角质层，不能形成复层上皮［１０］；而在快速增殖的鳞状上皮细胞癌中可以见到P63转录因子的高表达。    　　除上述之外，还有感觉神经肽P物质(substance P，SP）、α-连环素、白介素6等都在ESC的增殖分化中起着调控作用，新的调控因子及调控机制的研究都在不断深入，这将为ESC更好的应用于临床做好前期的工作。    　　在许多特殊情况下，其它的细胞可以转化为ESC。首先，人体ESC存在逆分化现象，即表皮细胞可逆向转化为ESC。其次，有研究证明［15］，表皮基底层的ESC受到破坏时，残存的皮下组织的间充质细胞如脂肪细胞有可能提供表皮再生的干细胞。其机制还不清楚，有待于进一步的研究。

　　4  ESC的临床应用    　　应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：低毒性；不需要完全了解疾病的确切机制；应用自身干细胞移植，可避免免疫排斥反应。现在应用干细胞在组织工程和基因治疗方面已成为新兴的研究方向。    　　在皮肤病方面，已有学者将外源性基因通过反转录病毒导入ESC，植入体内，结果显示机体可长期维持基因的表达。对于皮肤科的相关某些疾病如表皮松解、鱼鳞病等皮肤退行性病变，通过导入正常目的基因即可达到治疗目的。而且，这种基因治疗还对各种原因引起的皮肤肿瘤同样适用，通过导入肿瘤抑制基因，从而阻断肿瘤发生过程。    　　ESC在眼科的运用研究已经能应用自体角质细胞来抢救患者成为可能，角质细胞经过体外培养，角质形成细胞的数量可达5000-10000倍，形成可供移植的表皮膜，并已被成功应用于临床。Pekkegrini等给两例单侧角膜损伤的患者实施了角膜干细胞移植，发现再生角膜十分稳定，患者视力明显提高。    　　在烧伤整形治疗方面，ESC作不仅外维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，而且与创面修复紧密相关，是皮肤及其附属器发生、修复和改建的基础。张琮等研究证明用ESC、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植能够使创面迅速愈合［16］。廖立新等实验发现，用ESC构建的复合人工皮肤增殖能力强，新生的皮肤瘢痕轻，形态满意，创面愈合的速度和质量好；在胶原海绵上用ESC构建的复合人工皮肤增殖能力强，较好地解决了种子细胞的老化问题，可望成为一种较为理想的皮肤替代物［17］。ESC可以分化成为毛囊的特性，提示了其有治疗秃发的潜能［18］。有研究人员分离鼠ESC，显示单个的ESC能够分化成皮肤、毛发和皮脂腺，Elaine Fuchs［19］选取正常老鼠的ESC，并将其移植到无毛小鼠的背部，结果无毛小鼠背部出现了正常的有毛皮肤。在中医中药研究领域，孔焕宇发现，在烫伤后大鼠用红玉膏换药能加速创面愈合，减少创面愈合时间，整合素β1及转录因子p63在表皮层聚集增加，其作用机制可能与红玉膏能诱导创缘残留的ESC增殖分化有关［20］。目前，将皮肤干细胞按组织工程的原理构建皮肤，已成为解决临床治疗中皮源缺乏问题的根本途径，自体干细胞有望成为其可靠的种子细胞。    　　现在ESC的研究尚处于初级阶段，应用ESC增殖分化调控的研究将使人类更好的驾驭自身。随着研究技术的进步，分离、纯化ESC、更为精确的调控其增殖分化，必将推动临床的大跨步向前发展。如果能象分离ESC那样分离自身真皮干细胞，将为患者提供大量的自体表皮和真皮细胞，将为各种皮肤疾病和创伤疾病，以及怎样延缓人皮肤衰老提供新的方案，并将实现皮肤由解剖修复到功能修复的梦想。

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