应用纤维结合素建立新型兔腰椎间盘退变模型

椎间盘退变是引起下腰痛的重要原因之一。椎间盘退变早期尚无有效的治疗方法,晚期常用保守治疗或手术治疗。近来人们开始应用生物学治疗方法延缓或逆转椎间盘的退变,基因治疗、组织工程学方法先后用于椎间盘退变的研究,这些方法应用于人体之前都要用动物体内实验来验证其安全性和有效性。目前存在多种制作椎间盘退变动物模型的方法,但都存在缺陷,不能较好的模拟椎间盘退变的自然过程。我们应用兔椎间盘内显微注射纤维结合素片段的方法诱导生理性的退变,旨在为椎间盘退变分子机制的体内研究提供一种新型的、可靠的、重复性和模拟性好的动物模型。

材料与方法

一、实验动物及试剂仪器

成年新西兰大白兔34只,体重1.7~2.2kg,雌雄不限,购自山东省实验动物中心;术前行Ⅹ线检查证实脊柱无畸形,椎间盘为正常椎间盘。纤维结合素片段(Fn~f,30kDa,美国⒌gma公司);32G微量注射器(美国Ha血lton公司);番红0(美国⒌gma公司);Ⅱgit龃Radiograp”Machnc(德国⒊emens公司);石蜡切片机(RM2135,德国LEICA公司);倒置相差显微镜(TE2000Microscope,日本Nikon公司);35S-slllhte(英国Amersham公司);纤维透析袋[截流分子量(I2OO0~14OO0)×103,美国跏ectmm公司⒈无血清DMEM培养基(美国GIBCO公司);Rackbeta¨1209型液体闪烁计数器(瑞典LKB/WAL⒒C公司)。

二、实验方法

新西兰大白兔34只,随机分为实验组(16只)、对照组(16只)和空白组(2只)。氯氨酮全身麻醉下取腹外侧切口经腹膜后人路暴露L1~2,L2~3,L3~4,L4~5椎间盘;实验组动物椎间盘内用微量注射器显微注射Fn-f25ul(1umd/L),对照组注射PBS 25ul(0·01m。l/L),依次关闭切口,术后兔予以分笼饲养,自由活动及进食。空白组动物不做处理。术后4、8和12周处死实验组和对照组中各4只动物,椎间盘组织石蜡切片,番红O染色、HE染色进行组织学观察,35S整合分析法检测髓核蛋白多糖的合成。

实验组和对照组各取4只动物,于造模前、造模后4、8、12、16周行腰椎侧位数字化Ⅹ线(DR)检查。造模16周时处死,椎间盘行番红0染色、HE染色和蛋白多糖合成测定。空白组2只动物处死后检测髓核蛋白多糖合成,作为术前蛋白多糖合成率指标。

三、观察检测指标

1.组织学观察:椎间盘连同两侧终板置于10%福尔马林液固定,置人0.5m。l/L的EDTA4℃下摇振脱钙⒛d;梯度乙醇脱水;石蜡包埋,切片厚度4um和8um。椎间盘切片滴加番红O溶液1ml(⒊anine o 0.05g,95%乙醇溶液2ml,16ml蒸馏水),染色1~3血n,PBs冲洗1血n×3次。照相、封片、观察。实验椎间盘石蜡切片进行苏木素复染,脱水、透明、封片,观察,照相。

2.髓核组织35S蛋白多糖合成率的测定:髓核组织剪碎成约1mm3大小,称取质量后置人含35Sˉsu血tc(0.37GBq/L)的无血清DMEM培养基1ml中,37℃、5%C02培养箱培养48h,允许灬S-mlfate参与合成蛋白多糖;镜下观察培养液无污染后-⒛℃冻结,中止蛋白多糖合成。椎间盘组织和培养基解冻溶解装人纤维透析袋密封,4℃流水中透析3d,至透析液测定不到未整合的35S-sulfate。加入3ml木瓜蛋白酶(美国⒊gma公司),ω℃消化以h;臼℃、zh完全干燥,将干燥透析袋置入闪烁杯,加入闪烁液,液体闪烁计数器测定每分钟放射性计数(CPM),计算CPM与髓核质量(mg)的比值。

3.影像学观察:动物在行腰椎侧位DR检查时严格控制稳定的麻醉水平,维持相同的肌松弛程度。应用图像分析软件(Im吧eJI.绲,Natim龃,IⅡtitu龋of HeaIth,Bethc耐a,MD,USA)测量椎间盘前后缘高度(BC,EF)及上位椎体前后缘高度(AB,DE),根据h等[3]描述的方法计算椎间盘高度指数(DHI),再计算椎间盘高度指数百分比(DⅢ%),评估椎间盘的高度变化(图1)。计算公式如下:DHI=(BC+EF)/(AB+DE)DⅢ%=(DⅢ术后/DⅢ术前)×1OO%四、统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行数据录入及分析,计量资料采用死±s表示。实验组和对照组组内各时间点数据间比较采用单因素方差分析,两两比较采用sD法检验;实验组与对照组数据组间比较采用两独立样本的莎检验。以双侧检验P<0。O~o^为差异有统计学意义。

结果

—、组织学观察

1.番红O染色:实验组椎间盘4周时与对照组椎间盘相比,结构无明显差别;8周时髓核区明显缩丬、12周时髓核区进一步缩小,内层纤维环结构破坏,出现裂隙,纤维环前方出现骨赘;16周时髓核区同内层纤维环不能分辨,纤维环前方骨赘形成明显。对照组椎间盘在各时间点均可见到分界明显的髓核区,随时间进展无明显改变(图2,3)。

2.HE染色:造模后4周,实验组椎间盘纤维环排列整齐,板层结构清晰,髓核区细胞数目较多,边界清晰、染色较深;造模后8周,内层纤维环板层结构迂曲,结构紊乱,髓核区细胞数目减少,细胞边界模糊,分界不清;造模后12周,内层纤维环结构破坏,出现裂隙,髓核区细胞数目减少,细胞间出现纤维样结构;造模后16周,内层纤维环板层结构消失,可见多个软骨巢样结构及钙化区,髓核区细胞数目进一步减少,细胞间被纤维样组织填充,髓核区同内层纤维环不能分辨(图4,5)。

二、35s整合法测定蛋白多糖合成率空白组髓核组织蛋白多糖合成率为129±6作为术前结果。实验组4、8、12和16周随时间进展蛋白多糖合成率显著下降(F=%3.z1,P<0.01)。对照组在各时间点蛋白多糖合成率差异无统计学意义(F=2.267,P)0.05);LSD法两两比较,4、8、12周蛋白多糖合成率与术前比较差异均无统计学意义(P>0,O~。^);16周与术前比较差异有统计学意义(P=0.0O6)。术后各时间点,实验组合成率与对照组比较均显著降低(P(0.05,表1)。

二、影像学观察结果造模前实验组动物DR检查示椎体排列整齐,椎间隙清晰,高度正常,椎体前后缘均无增生骨赘;造模后4周,椎间盘高度无明显下降,椎体周围无骨赘生成;造模后8周,椎间盘高度出现下降,椎体边缘变毛糙、轻微增生;造模后12周,造模椎间隙较术前模糊,椎间盘高度明显减低,造模椎间盘及相邻椎体前缘出现增生骨赘;造模后16周,造模椎间隙明实验组随时间进展DHI%明显下降(F=1T9242,P(0.01)。对照组各时间点DHI%比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组4周时DHI%与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),8、12和16周均较对照组明显减低(P(0.01,表2)。

讨论

椎间盘退变是下腰痛及其他退行性脊柱疾患的主要原因,动物模型的建立对于椎间盘退变的实验和临床研究具有重要意义[4]。椎间盘退变动物模型分为自发性模型和诱发性模型,自发性退变模型应用较少,鼠或兔的诱发性模型应用较广[5]。诱发性退变模型包括应力改变诱发、结构损伤诱发、化学物质诱发和基因诱发模型。双足鼠、鼠尾悬吊、轴向负荷和脊柱结构破坏均可改变应力模式导致退变,但正常结构和应力的破坏导致其重复性和可应用性较差,无法用于进一步研究[5]。结构损伤模型主要包括纤维环损伤和软骨终板损伤2种。纤维环损伤模型较为多用,但其发生的快速的椎间盘退变和髓核脱出被认为是非生理性的,进一步应用受到限制[6]。Hdm等[7]损伤家猪的软骨终板诱导椎间盘退变,但终板破坏导致椎间盘发生血管增生和炎症反应。胶原酶、糜木瓜酶、软骨素酶ABC等化学物质和基因修饰也被用来诱导椎间盘退变,这些模型重复性和模拟性较差,且存在排异反应和伦理问题。因此,寻找一种无创或微创,较好的模拟人椎间盘退变的自然过程,进展缓慢并可用于进一步分子学研究的椎间盘退变模型很有必要。Singh等[5]认为,理想的椎间盘退变动物模型应满足以下条件:(I)符合伦理的;(2)重复性好,退变程度可控性好;(3)易操作性和经济性;(4)与人椎间盘退变的病理过程具有相似性和可比性。纤维结合素是一类基质蛋白降解分子,存在于正常和退变的动物和人体软骨和椎间盘内[10],可以抑制基质的合成、促进其分解,诱导软骨和椎间盘退变[11]。Andc硌0n等[ρ]证实Fll-f可以促进髓核细胞内基质金属蛋白酶(MMP)9、MMP-13和Fas基因表达,Ⅱ型胶原、聚合蛋白聚糖基因表达下降。体内研究发现,纤维环切割后,兔椎间盘内纤维结合素表达明显增高;兔体内椎间盘注射Fn~f,可发生较纤维环切割模型进展更加缓慢的退变[13]。Fn-f诱导的软骨和椎间盘细胞的代谢改变具有剂量和时间依赖性。Homandberg等[14]发现高浓度的Fn-f可导致软骨破坏;低浓度的Fll可诱导胰岛素样生长因子1和转化生长因子(TGFβ1)释放,提高蛋白多糖合成。Aota等发现低浓度的Fn-f促进外层纤维环细胞中蛋白多糖的合成,高浓度的Fn-f抑制其蛋白多糖合成。

我们应用显微注射Fll的方法,制作兔椎间盘退变模型。实验组椎间盘造模4周后,髓核区进行性缩小,细胞数目减少,纤维环结构破坏,椎间盘高度降低;至16周时,髓核区消失,细胞数目少,细胞间为纤维样组织填充,椎间盘高度仅为造模前的2/3左右,增生骨赘明显。实验组蛋白多糖合成率4周即出现明显改变,进行性下降,至16周时下降至对照组1/3左右;对照组蛋白多糖合成无明显下降趋势,16周时较术前下降考虑与自然发生的退变相关。结果证实,造模后4~8周时椎间盘退变符合Thompson分级的I~Ⅱ级,可以较好的模拟早期退变,应用于分子研究。Fn-f诱导的病理生理改变与人椎间盘自然退变过程一致。

Fn-f制作的兔椎间盘退变模型具有以下特点:(1)纤维结合素是动物和人体椎间盘内本身就存在的物质,不会产生排异或伦理问题[1O]。(2)研究证实,应用直径小于刃G针头纤维环穿刺,不会导致椎间盘高度丢失,我们应用32G微量注射器注射微量的Fll,对椎间盘产生非常微小的损伤和影响,且定量注射易于重复。(3)Fn-f诱导的退变进展缓慢,有利于进行椎间盘退变的生物学治疗研究。(4)Fn-f诱导的椎间盘组织学、影像学和蛋白多糖合成的改变,与人椎间盘自然退变过程更加相似,具有较好的模拟性。(5)应用兔作为研究对象更加经济。综上所述,Fn-f诱导的兔腰椎间盘退变为体内研究提供了一种新型、实用的动物模型。Fn-f的作用机制以及应用Fn-f动物模型进行椎间盘退变分子机制和治疗的研究,都有待进一步深人。

参考文献

Woods BI,Vo N,Sowa G.Gene therapy for intervertebral disk degeneration[J].Orthopedic Clinics of North America,2011.563-574.

李旭,侯筱魁.椎间盘组织工程研究进展[J].中华外科杂志,2005,(24):1616-1618.

LüDS,Shono Y,Oda I.Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics.An in vivo biomechanical,radiologic,and histologic canine study[J].Spine(Phila Pa 1976),1997.1828-1835.

Andersson GB,An HS,Oegema TR Jr.Directions for future research[J].Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume,2006,(Suppl 2):110-114.

Singh K,Masuda K,An HS.Animal models for human disc degeneration[J].Spine Journal,2005,(6 Suppl):267S-279S.

Lipson SJ,Muir H.1980 Volvo award in basic science.Proteoglycans in experimental intervertebral disc degeneration[J].Spine(Phila Pa 1976),1981.194-210.

Holm S,Baranto A,Kaigle Holm A.Reactive changes in the adolescent porcine spine with disc degeneration due to endplate injury[J].Vet Comp Orthop Traumatol,2007.12-17.

Sasaki M,Takahashi T,Miyahara K.Effects of chondroitinase ABC on intradiscal pressure in sheep:an in vivo study[J].Spine(Phila Pa 1976),2001.463-468.

Sahlman J,Inkinen R,Hirvonen T.Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2al gene for TypeⅡcollagen[J].Spine(Phila Pa 1976),2001.2558-2565.

Oegema TR Jr,Johnson SL,Aguiar DJ.Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc[J].Spine(Phila Pa 1976),2000.2742-2747.