高血糖大鼠脑出血后脑水肿及COX2的变化

　　作者：陈江波,娄季宇,王金兰,白宏英,范顺太　　作者单位：郑州大学第二附属医院神经内科 郑州

　　【摘要】 目的 观察高血糖对脑出血后脑水肿及COX2表达的影响，探讨胰岛素是否具有神经保护作用。方法 采用STZ法诱导高血糖模型，立体定向技术制作大鼠脑出血模型，干湿重法测量脑组织含水量和免疫组化法测定脑组织COX2的表达。结果 与正常血糖组模型大鼠比较，高血糖组大鼠脑组织含水量明显增加(P<0.05)，血肿周围COX2阳性细胞表达明显增高(P<0.05);而胰岛素干预使上述各项指标降低至正常血糖组水平。结论 COX2参与了大鼠血肿周围脑组织损伤的病理生理过程，高血糖可加重脑组织损伤，胰岛素则对神经有保护作用。

　　【关键词】 高血糖,胰岛素,脑出血,脑水肿;COX2

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of hyperglycemia on brain water content and the brain tissue expression of COX2 in rat models of experimental ICH，and explore whether insulin can play neuroprotection effect.Methods Hyperglycemia models were induced by streptozotocin (STZ), ICH rat model was made by stereotactic technique .The brain water content were measured, and COX2 expression with immunohistochemistry after ICH were measured.Results Compared with those of normal plasma glucose group, the brain edema of the hyperglycemia group rats became worse significantly at the same time (P<0.05), protein expression of COX2 was higher than the other groups(P<0.05); Moreover，those parameters in the insulin intervention group were better than those in the hyperglycemia group, even similar with those in the normal glucose group.Conclusion COX2 is involved in pathophysiologic process of ICH.Hyperglycemia is harmful to the brain damage,While insulin may play the effect of neuroprotection.

　　【Key words】 Hyperglycemia; Insulin; ICH; Cerebral edema; COX2

　　众所周知，糖尿病是脑出血的重要危险因素之一。现有研究结果显示高血糖不仅促进脑出血的发生，而且可以扩大脑水肿体积，加重功能损害，影响预后，而其造成上述恶化的具体机制尚不十分清楚，本研究目的在于探讨高血糖脑出血大鼠中COX2的作用，并观察胰岛素对其影响，进一步探讨脑出血后脑水肿的形成机制，为防治脑出血提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物和分组 成年雄性清洁级Wistar大鼠96只，体质量200～250g, 由郑州大学动物实验中心提供。按照随机化的原则将实验动物分为4组，即假手术组、正常血糖组、高血糖组和胰岛素干预组。每组均设4个时间点：6h、24h、72h、7d。每个时间点设6只大鼠。

　　1.2 高血糖大鼠模型制作及胰岛素干预方法 参照STZ诱导法制备高血糖大鼠模型[1]。以STZ 60mg/kg，对高血糖及胰岛素干预组大鼠单次腹腔注射。大鼠正常血糖值为4～6mmol/L，注射后1周检测血糖≥11.1mmol/L为成功模型备选用。高血糖模型成功后，予干预组大鼠普通胰岛素，腹壁皮下注射，3次/d，4U/次，连用3d，测血糖值达正常范围。

　　1.3 脑出血模型的建立 参考Rosenberg等[2]方法建立脑出血模型，大鼠用10%水合氯醛(0.4g/kg)腹腔麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上，使大鼠前囟和后囟在同一平面，以前囟中央为原点，取前囟点右侧中线旁开3mm，后1mm为进针点，即尾状核位置，进针深度为6.5mm。正常血糖组、高血糖组和胰岛素干预组被缓慢注入50μl自体动脉血，动脉血采自股动脉;假手术组注入50μl灭菌生理盐水，15～20min注完，留针5min后缓慢将针退出，缝合皮肤。

　　1.4 标本及病理切片的制作 各组大鼠在相应时间点断头取脑，以右侧大脑半球中部注射针眼处冠状位切割脑组织，可见在尾状核部位有血肿，取针孔前约2 mm厚的脑组织进行脑含水量测定。取针孔后约4 mm层厚的脑组织，固定在10%福尔马林液中24 h，标本依次梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，在石蜡切片机上连续切片，片厚4μm，相邻切片分别作免疫组化和常规HE染色。

　　1.6 脑含水量的测定 首先测得切取的脑组织的湿重;然后将用铝箔包好的脑组织放入95℃的恒温烤箱内烘干24h，取出待测脑组织恢复到室温后称重为干重，脑组织含水量的计算公式为：湿重-干重/湿重×100%,测重用电子天平(精确度为0.1 mg)。

　　1.7 图像采集分析 每张图像选取6各不同的视野，在×40物镜下，利用德国Leicai显微照相系统和上海山富科学有限公司Biosens Digital Imaging System 图像分析软件，计算每组大鼠血肿周围COX2阳性细胞的平均积分光密度。

　　1.8 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。各项检测结果均以均数±标准差(±s)记录。2组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，脑水肿与COX2的相关性采用直线相关分析，检验水准取α=0.05，当P<0.05时有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 脑组织含水量的变化 假手术组脑含水量随时间延长，没有明显变化;6h时正常血糖组脑含水量开始增加，24 h时与假手术组相比明显增加(P<0.05)，而高血糖组增加更为显著，至72h达到高峰，与假手术组及正常血糖组比较均P<0.05;胰岛素干预组血肿周围脑组织含水量各时间点均明显高于假手术组(P<0.05)，低于高血糖组(P<0.05)，接近于正常血糖组。

　　2.2 脑血肿周围COX2的表达情况 光学显微镜下，DAB染色阳性细胞呈棕黄色或褐色，正常血糖组、高血糖组和胰岛素干预组的脑血肿周围组织均有COX2的表达，表达在6h时开始增高，24h时间点显著增高，至72h表达水平达到高峰，7d时仍有表达 。

　　2.3 高血糖组大鼠血肿周围脑组织中COX2表达和脑含水量的相关分析 Pearson’s相关分析发现,COX2表达与脑含水量呈正相关(r=0.988,P<0.05)。

　　3 讨论

　　目前有关高血糖与卒中的关系主要集中在与脑梗死方面，而与脑出血的研究则相对较少。由于脑出血后血肿周围同样存在缺血半暗带，高血糖对血肿周围被压迫的缺氧状态下的脑组织具有明显的损害作用。

　　COX2与脑出血后继发性缺血损伤和大量自由基产生有关。本研究发现,实验性大鼠脑出血后COX2在6h即有表达，24h明显增高,至72h达到高峰, 之后逐渐下降，7d时仍有表达，神经元、毛细血管内皮细胞和血肿周围浸润的白细胞中均有COX2表达，各时点与假手术组比较均有显著差异(P<0.05),此结论与文献的报道[3]基本一致。COX2是花生四烯酸代谢的关键酶, COX2 mRNA和蛋白在脑出血后表达增加提示,其代谢产物PG和TXA2产生增加。TXA2是一种很强的缩血管和促血栓形成因子,可增加脑微循环阻力,通过收缩血管加重局部脑缺血,引起血管通透性变化,神经细胞水肿,加重神经元损害。它可促进脑血管痉挛和微血栓形成,其结果是CBF下降,出血后脑损伤加重。另外,COX2还可通过对NO通路的调节诱导诱导型一氧化氮合酶( iNOS)mRNA表达,增加氧自由基NO的产生[4]。以上机制均可引起出血后血肿周围神经细胞的持续损伤,神经细胞结构和功能破坏,导致继发性神经细胞死亡。

　　高血糖可加重脑出血后的脑组织损伤，血糖变化在某种程度上反映了脑组织损伤的严重性，测定血糖对评估预后有一定意义[5]。本研究结果发现，高血糖组大鼠各个时间点脑含水量均高于正常血糖组(P<0.05)，血肿周围和COX2的表达也明显增高，而且脑出血后脑水肿的变化与COX2的表达在时间上的趋势基本平行，经统计学分析二者在时程上呈正相关，相关系数为0.988(P<0.05)。此结果与上述文献报道有相似之处，这说明COX2参与了脑水肿的形成，推测其原因可能是高血糖加重脑水肿，使COX2表达增加，COX2表达增加又进一步加重脑水肿，形成恶性循环，使脑损害进一步加重。

　　在认识到高血糖对脑缺血损伤危害性同时，控制血糖水平治疗即成为脑血管病治疗手段之一，特别是采用胰岛素降低血糖水平纳入急性脑卒中治疗指南。已有研究发现胰岛素对急性期脑出血周围脑组织的缺血性损伤有保护作用。可能机制为：现已发现脑中存在胰岛素受体，胰岛素可与胰岛素受体结合，降低脑细胞对糖的摄取，从而降低脑细胞内糖的储存，减少乳酸产生的底物，从根本上纠正细胞酸中毒[6];同时胰岛素还可以降低外周血糖浓度，增加出血周围水肿带的有效血供，造成相对低血糖高灌流状态，从而对脑损害产生改善作用。本研究证实通过胰岛素干预可减小高血糖水平大鼠脑出血所致水肿体积，减少炎性细胞表达，减轻脑损伤。当然对临床脑出血与血糖关系及胰岛素干预作用的认识还需多方面实验明确。

　　【参考文献】

　　1] 李聪然，游雪甫，蒋建东.糖尿病动物模型及研究进展[J].中国比较医学杂志，2005，15(1):5963.

　　[2] Rosenberg GA,MunBryce S，Wesly M,et al.Collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990,21(5):801805.

　　[3] Gong C, Ennis SR, Hoff JT, et al. Inducible cyclooxygenase2 expression after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Brain Res, 2001, 901(1/2): 3846.

　　[4] Muhl H, Kunz D, Pfeilshifter J. Expression of nitric oxide synthase in rat glomerular mesangial cells mediated by cyclic AMP[J]. Br J Pharmacol, 1994, 112(1): 18.

　　[5] 白焕芳，刘会峰 . 血糖水平对脑出血急性期病情及预后的影响[J].河南实用神经疾病杂志，2004，7(2)：8485.

　　[6] 周成业，黄如训，曾进胜.胰岛素治疗肾血管性高血压大鼠脑梗死的试验研究[J].临床神经病学杂志，2000，13(11)：137139.