干细胞移植延缓椎间盘退变及磁共振示踪研究

　　作者：鲍军平，吴小涛，王运涛，张福勇，朱磊 作者单位：东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：评价超顺磁性氧化铁纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)在椎间盘退变早期植入椎间盘后细胞外基质的表达情况，并用磁共振进行干细胞示踪。方法：采取体外细胞培养技术，体外纯化扩增兔BMMSCs，并用氧化铁纳米粒子进行标记，于退变手术当时植入手术节段椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化，用磁共振扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。所得数据进行统计学处理。结果：8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量明显较模型组高,差异有统计学意义，但与正常组比较差异无统计学意义。结论：兔BMMSCs移植可以延缓甚至阻止髓核退变。

　　【关键词】 椎间盘退变; 髓核; 骨髓间充质干细胞; 干细胞移植; 超顺磁性氧化铁

　　椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是引起下腰痛的常见病因之一，严重影响人们的生活质量。IDD导致脊柱的生物力学功能紊乱，从而影响脊柱的功能。椎间盘突出症是骨科的常见病和多发病，是腰腿痛最常见的原因。一般认为腰椎间盘突出症是在IDD的基础上发生的。但青少年椎间盘突出症患者可在无退变时因强大暴力引起纤维环破裂和髓核突出，该类患者随年龄的增长发生IDD的可能性增加。自提出骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)概念以来，利用其修复组织损害和促进功能恢复作用的治疗方法成为目前医学领域中最引人关注的热点之一。已有的研究结果显示，移植BMMSCs可能成为治疗IDD的一种新方法[1]。本研究旨在探讨早期干细胞移植有无减缓甚至阻止髓核丢失造成IDD发生的可能性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　LG-DMEM培养基(美国Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Percoll液(美国Pharmacia公司,密度1.077 g·L-1)，抗Ⅱ型胶原抗体(美国ADL公司)，7.0 T MR仪(德国Bruker公司)，5%CO2 细胞培养箱(德国 Herabus公司)，数码照相机(日本Nikon公司),一次性培养瓶、培养板(Corning公司);新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔BMMSCs的分离培养方法

　　取1月龄新西兰大白兔6只,雌雄不拘,平均体重1.2kg(1.1～1.25kg)，3%戊巴比妥钠按1ml·kg-1的剂量施以全身麻醉;无菌操作下于双侧胫骨上端用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径2～3mm的孔通达髓腔;用18号骨穿针接注射器,内含3000U·ml-1的肝素0.1ml,沿骨皮质上的孔穿入髓腔抽出骨髓血约2ml;抽出的骨髓血用PBS洗涤2次后,800r·min-1离心5min;弃去上清液,沉淀用LG-DMEM培养液重新打匀，制成单细胞悬液;将单细胞悬液缓慢加入预先加有密度为1.077g·L-1的Percoll单核细胞分离液的离心管中,2000r·min-1离心20min,吸取中间的白膜层,用PBS冲洗2次后,800r·min-1离心5min，以2×105ml-1密度接种于20%胎牛血清的LG-DMEM培养基,置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱。4～5d后首次换液,以后每3d换液1次,逐次递减血清浓度,直至为10%。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。细胞生长融合达90%以上,以0.25%胰蛋白酶消化,按1传2比例分瓶接种传代培养。此为传一代,记为P1,以此类推,分别获取P2、P3、P4……P10代间充质干细胞。以P3代细胞作为注射用细胞。

　　1.2.2 超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记细胞

　　用SPIO进行标记，标记Fe浓度为25μg·ml-1,共同孵育24h。除去培养液后PBS反复漂洗，消化细胞，留取少量细胞爬片进行普鲁士蓝染色证实细胞内铁，其余制成单细胞悬液用于移植，细胞浓度为2×106ml-1。

　　1.2.3 分组及手术方法

　　纯种成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,平均体重2.5kg，随机分成对照组、实验组和模型组各8只。后两组全麻下采用腰椎侧前方倒八字手术入路,于腹膜外进入腰椎的侧前方,找到腰椎间盘,于L2,3、L3,4、L4,5,用21号针头针刺抽吸椎间盘，抽出组织湿重约5mg。实验组在对应的椎间盘内注射干细胞悬液20μl，模型组注射磷酸缓冲液(PBS)20μl,在每个相应椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线作标记,用于以后取样观察。然后冲洗、止血,依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况，肌肉注射抗生素预防感染。

　　1.2.4 髓核基质含量测定

　　将实验组、模型组、对照组随机分为2、4、6、8周组4个亚组,每组2只兔; 在相应时间于兔耳缘静脉注射空气10ml处死,立即取出兔腰椎并辨认原椎间盘定位标记,确认3组相应椎间盘。

　　1.2.4.1 蛋白多糖含量测定 采用间苯三酚分光光度法[2]测定光密度值,转换为量值作蛋白多糖含量的测定。

　　1.2.4.2 病理学检测方法 取出的相应椎间盘置10%中性福尔马林保存，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、免疫组化(SABC法)检测，一抗为抗兔Ⅱ型胶原的单克隆抗体(1∶100)，DAB显色。免疫组化结果判断：阳性细胞间质呈棕黄色，应用CLeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫染色的髓核细胞间质的灰度值(灰度分级0～255级,0级为最深,255级为最浅),每只兔取4张切片,每组共8张,每张切片随机采集4个高倍视野(×200)进行测定(向同一个方向移动切片,不重叠,不重复) 。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。

　　1.2.5 髓核MR扫描

　　另取纯种成年新西兰大白兔3只,雌雄不限,平均体重2.5kg,按上述手术操作暴露椎间盘，不抽吸髓核直接注射SPIO标记的BMMSCs。分别于移植细胞后0、2、4周处死，取相应节段髓核作MR扫描。

　　1.3 统计学处理

　　所得数据以x-±s表示，并输入SPSS11.5统计学软件进行统计学处理。相同时间点的3组间先进行单因素方差分析，再进行两两q检验。

　　2 结 果

　　2.1 BMMSCs生长及形态观察

　　原代细胞接种后24h细胞开始贴壁，多呈圆形或类圆形，随培养天数的增加，细胞逐渐伸张为多角形或梭形，渐有集落形成;7d后细胞集落逐渐增多扩大，并彼此融合，细胞呈现梭形外观;10～12d细胞融合达90%以上，漩涡状排列，界限不清，可以传代。经0.25%的胰蛋白酶消化后的细胞呈圆形，分瓶接种后12h内开始贴壁。传代后的细胞增殖加速，培养6～9d即可再次传代(图1)。

　　2.2 SPIO标记的干细胞

　　传至第3代的细胞与磁粒子共同孵育24h，PBS反复漂洗后高倍镜下即可观察到细胞内分布有大量的黄黑色铁颗粒。细胞爬片普鲁士蓝染色(图2，见封二)，几乎每个标记细胞的胞质内均可见到蓝色颗粒，标记率近100%，与文献报道相同。

　　2.3 MR扫描

　　移植SPIO标记的BMMSCs的正常髓核不同时间MRI T2像对比，即时扫描发现注入的磁粒子形成一个低信号的浓聚区，周围为高信号的正常髓核组织，而4周后的髓核T2像即表现为均一的低信号，提示SPIO标记的干细胞植入髓核内后由移植中心区向周边髓核发生迁徙(图3)。

　　2.4 蛋白多糖含量测定结果

　　术后2、4、6、8周,实验组及对照组与模型组间蛋白多糖测定值经方差分析,差异有统计学意义(均P<0.01)。各组间再行两两q检验。各个时间点实验组与模型组及对照组与模型组之间,差异有统计学意义(均P<0.01),各时间点实验组与对照组间,差异无统计学意义(均P>0.05)(表1)。表1 不同时期各组髓核组织蛋白多糖含量 表2 不同时期各组髓核组织Ⅱ型胶原定量分析

　　2.5 病理学检测结果

　　实验组和对照组髓核组织Ⅱ型胶原染色呈强阳性,2周即显示阳性染色。模型组呈阴性或弱阳性反应(图4，见封二)。术后2、4、6、8周,3组间测定值经方差分析,实验组与模型组及对照组间，P<0.01,组间差异有统计学意义。各组间再行两两q检验。各个时间点实验组与模型组及对照组与模型组之间,差异有统计学意义(均P<0.01),各时间点实验组与对照组间,差异无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

　　3 讨 论

　　IDD是引起下腰痛的常见病因之一，基因、环境和年龄因素都可导致IDD的发生。目前认为IDD的标志是蛋白多糖、水分、Ⅱ型胶原的丧失以及髓核中类软骨细胞向纤维细胞的转变[3-4]。随着对IDD机制认识的不断深入，细胞移植修复退变椎间盘成为一种可能的生物学治疗方法。基于对椎间盘组织退变机理的认识,目前的研究把焦点集中在椎间盘细胞,尤其是终板软骨细胞和髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)上,因为只要激活椎间盘细胞,改善细胞外基质,就可能在一定程度上缓解甚或逆转椎间盘组织退变的发生。

　　BMMSCs是在少数骨膜和骨髓中发现的未分化细胞，其有向间叶组织来源的连接组织细胞分化的独特能力。实验研究已证实BMMSCs可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和上皮细胞[5-9]等。它易分离和培养，可用于骨、软骨或肌腱的再生，在同种异体活体内具有高扩张潜能且不发生免疫排斥反应或发生程度较轻，使这类细胞成为一种能在临床广泛应用的细胞和基因治疗的工具[10]。

　　Yamamoto等[11]评价了BMMSCs对于NPCs生物学和代谢活力的滋养功能，发现与BMMSCs接触培养的NPCs无论是细胞增殖、DNA合成、蛋白聚糖合成还是表达细胞因子的量都较单独培养的NPCs有明显的上调。Sakai等[12]用绿色荧光蛋白标记的自体BMMSCs移植入成年家兔退变髓核中，结果显示植入的细胞可以增殖并且表达出一些NPCs的特征性表型，RT-PCR提示髓核内蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平明显上调。Zhang等[13]用兔同种异体BMMSCs注射入兔的椎间盘,与未注射组和注射盐水组在1、3 和6个月时分别检测mRNA、蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量,结果显示注射BMMSCs 组均明显增加。注射BMMSCs可能是一种治疗退变椎间盘的方法。Sakai等[14]将BMMSCs 在家兔退变椎间盘模型制成2周后,分别移植入L2,3、L3,4及L4,5椎间盘,24周后检查正常椎间盘、模拟手术椎间盘和移植后椎间盘的X线片椎间盘高度、MRI T2信号的改变、组织学和免疫组化的变化、基质关联的基因表达情况。结果显示移植BMMSCs组椎间盘的高度为正常对照组的91%,T2信号强度为正常对照组的81%,免疫组化和基因表达分析有蛋白多糖积聚。认为BMMSCs移植对退变的家兔椎间盘的再生是有效的,对于退变的椎间盘疾病是一个有价值的治疗方法。

　　上述实验均是BMMSCs移植修复退变椎间盘的研究，对于即将发生退变的椎间盘BMMSCs移植有何作用未见报道。临床常见的青少年椎间盘突出症患者，椎间盘尚未发生明显的退行性变化，但髓核组织丢失使发生退变性疾病的可能性增加。该类患者若需手术治疗，我们考虑是否可以用BMMSCs移植替代丢失的髓核组织以延缓甚至阻止退变发生。在本实验中，我们用新西兰兔模拟髓核丢失患者，在退变发生前用BMMSCs进行干预，发现8周内髓核中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的含量都明显高于模型组，差异有统计学意义，但与正常对照组均无差异，说明在椎间盘发生退变的早期，给予干细胞治疗有可能阻止退变的发生。这给青少年椎间盘突出症患者的临床治疗提供了新思路。

　　SPIO是一种纳米粒子，即使在较低的浓度下也可以在MR下成像。成像原理为氧化铁纳米粒子通过细胞内吞作用进入细胞内,再将标记好铁颗粒的细胞以一定量注入动物模型或人体内,可产生T2负性对比效应,经MR扫描获得信号对比来显像。实验研究已经证实SPIO标记BMMSCs的合适Fe浓度为25μg·ml-1，该浓度下细胞的增殖及分化活性不受影响，孵育18～24h后标记率可达到100%。本实验采用活体移植模型，用SPIO标记干细胞，应用高场强的MR对其进行示踪，观测到干细胞植入正常椎间盘后有从植入部位向周边髓核迁徙的趋势。Sobajima等[1]对移植后BMMSCs的分布位置进行了研究。他把人BMMSCs和人NPCs在活体外片状培养基中共同培养,最后发现人BMMSCs在培养基上的位置取决于人BMMSCs和人NPCs两者的比例。而在兔模型上BMMSCs的位置和时间有密切关系:在12周以前,干细胞主要位于髓核,但在24周后,可观察到干细胞向纤维环区域迁移,并在形态学上表现出更接近于自体纤维环细胞的特征。干细胞发生迁徙的机制目前尚未见报道，有待进一步研究。

　　综上所述，干细胞移植修复IDD有很广阔的前景，BMMSCs凭借其分化多向性和易于分离培养扩增等特点,不仅是很好的基础研究的实验材料,也为干细胞组织工程学提供了一个很好的细胞来源和基因治疗载体，为许多疾病的治疗开辟了新天地。希望是无限诱人的,但必须清醒地看到,IDD的确切机制尚待进一步研究,在退变椎间盘中移植细胞的类型、细胞移植是否用支架,以及细胞移植后的营养途径等问题需深入研究,确定细胞表型的特征、诱导和控制BMMSCs分化成髓核或纤维环细胞的因子为下一步研究重点。随着组织工程学的发展及人们对脊柱基础研究的深入,应用组织工程技术完全有希望培育出具有生物活性和功能的人工生物椎间盘组织,为脊柱退变性疾病的治疗带来新的观念和模式。

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