ｒＡＡＶ１-ＥＧＦＰ和ｒＡＡＶ２-ＥＧＦＰ转染犬骨髓间充质干细胞的比较

　　作者：刘斌，蔡道章，戎利民，王昆，曾春，谢沛根 作者单位：中山大学附属第三医院骨科， 广东 广州 510630

　　【摘要】 研究不同血清型腺相关病毒(rAAV)载体介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)对体外培养犬骨髓间充质干细胞(MSC)的转染效率及其毒性作用。【方法】 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSC，倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态，透射电镜观察其超微结构，流式细胞仪鉴定其表面标记物。取第3代MSC，以MOI为104 ～ 105 v.g./cell 的rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP进行转染，3、7、21 d后荧光显微镜观察检测转染效率;MTT法检测rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP对MSC的毒性作用。 【结果】 原代及传代培养的MSC呈梭形外观，具有较强的增殖能力。MSC超微结构显示其胞体较小，细胞核/浆比例大，胞浆少，染色质较疏松。细胞表面抗原CD29、CD44表达阳性，CD34表达阴性。随MOI的增加及时间的延长，rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP对犬MSC的转染效率逐渐增加，rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(P < 0.01)。转染MSC细胞后，细胞生长正常，MTT法显示各转染组与未转染组的光密度值无统计学差异(P > 0.05)。 【结论】 相对犬MSC，rAAV2是一种比rAAV1更优越的转基因载体，而且对细胞生长无明显抑制，作为组织工程种子细胞的载体是安全可行的。

　　【关键词】 骨髓间充质干细胞; 腺相关病毒; 增强绿色荧光蛋白; 组织工程; 犬

　　Comparison of Transfection Effect between rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFPinto Canine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells　LIU Bin， CAI Dao-zhang*， RONG Li-min， WANG Kun， ZENG Chun， XIE Pei-gen　Department of Orthopaedics， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China　Abstract： 【Objective】 To investigate the influence of enhanced green fluorescent protein gene mediated by recombinant adeno-associated virus vector with different serotypes on the transfection efficiency and cytotoxicity to canine bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. 【Methods】 The MSC from canine bone marrow were isolated and cultured in vitro by density gradient centrifugation and adherence screening method. The morphology of MSC was observed by inverted phase contrast microscope and Giemsa stain. The ultrastructure of MSC was observed by transmission electron microscope. The flow cytometry was used to detect surface antigens of MSC. The third passage of MSC were transfected with rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFP at the MOI of 104 ～ 105 v.g./cell. After 3， 7， and 21 days， the transfection efficiency was detected by the fluorescence microscope. MTT was performed to detect the cytotoxicity of rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFP on MSC. 【Results】 The MSC appeared morphologically as spindle-shaped and showed active proliferative capacity in primary and passage cultures. It showed that the ratio of cellular nucleus and cytoplasm was high and chromatin was loosened with TEM. Flow cytometry analysis indicated that MSC were universally positive for CD29 and CD44， but negative for CD34. With the increase of MOI and the extension of time， the transfection efficiency of rAAV2-EGFP enhanced， which was higher than that of rAAV1-EGFP into MSC (P < 0.01). After transfection， the growth of MSC was normal. MTT detection showed that there was no significant difference of the value of OD in MSC between transgenic and no transgenic group(P > 0.05). 【Conclusion】 rAAV2 is a better vector of gene transfection intocanine MSC than that of rAAV1. rAAV2 has no inhibition effect on the MSC’s growth， therefore， it is a safe and feasible vector for the seed cells of tissue engineering.

　　Key words： mesenchymal stem cells; adeno-associated virus; enhanced green fluorescent protein; tissue engineering; cainine

　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC)具有多向分化的潜能，可将其在体外培养、增殖、诱导后分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌细胞等，是目前组织工程的种子细胞之一[1-3]。腺相关病毒(adeno-associated virus， AAV)载体是目前已知的可以整合在染色体上长期表达而不致病的病毒载体，但AAV载体对不同的细胞转染效率存在差异;而且对于同一种细胞，不同血清型的AAV载体转染效率也不尽相同[4-6]。目前，AAV载体对MSC的转染情况少有报道，对于不同血清型AAV载体对犬MSC的转染效率的比较则未见报道。为明确AAV1与AAV2载体对MSC的转染特点和表达效率，我们就AAV载体介导的报告基因增强绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein， EGFP)对体外培养犬MSC的转染情况进行了观察。

　　1 材料和方法

　　1.1 犬MSC的分离培养与鉴定

　　1.1.1 犬MSC的分离和培养

　　30 g/L戊巴比妥钠静脉麻醉后骨穿针行髂后上棘穿刺，抽取骨髓组织约5 mL，1 000 r/min(r = 15 cm)离心7 min，去脂肪及上清液，l-DMEM重悬细胞，沿管壁缓慢滴加底部有等量Percoll(1.073 g/mL)分离液的离心管中，2 000 r/min(r = 15 cm)离心15 min，吸取中间界面白膜层，用L-DMEM洗涤，1 200 r/min(r = 15 cm)离心5 min，弃上清，重复1次，加入l-DMEM完全培养基(含体积分数10% FBS，青霉素钠100 U/mL、链霉素100 U/mL)，以4 × 104 /cm2接种于T-25培养瓶，置于37 ℃、体积分数5% CO2和饱和湿度的孵箱内培养。48 h后换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。相差显微镜观察照相细胞形态和生长情况，待细胞达到80% ～ 90%融合时，用2.5 g/L胰酶(含0.2 g/L EDTA)消化传代培养。

　　1.1.2 Giemsa染色观察细胞形态

　　将第3代细胞MSC于内置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片。用甲醇与冰醋酸(体积比3：1)固定5 min，干燥后加Giemsa染液染色15 mim，冲洗、干燥，中性树脂封片。

　　1.1.3 透射电镜观察

　　收集第3代MSC，25 g/L冷戊二醛固定后，PBS洗涤，10 g/L 锇酸后固定，梯度丙酮脱水，常规包埋、超薄切片，20 g/L醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察其超微结构。

　　1.1.4 MSC表面抗原的流式细胞仪检测

　　取培养的第3代MSC，弃去培养液，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，用含体积分数10% FBS的l-DMEM终止消化，吹打、离心收集细胞，用0.01 mol/L PBS漂洗2次。分别取1 × 106 /mL密度的细胞悬液 50 μL与抗CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC抗体10 μL在室温下避光孵育20 min。0.01 mol/L PBS洗涤2次后，将洗涤后的细胞离心后重悬于0.5 mL PBS中，应用流式细胞仪检测分析。

　　1.2 rAAV-EGFP转染犬MSC

　　1.2.1 rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP转染MSC

　　取第4代MSC， 2.5 g/L的胰酶消化后，应用含体积分数10%FBS的l-DMEM液终止消化，吹打后离心，将细胞以2 × 104个/孔接种于2块12孔培养板， 37 ℃孵育过夜，以无血清DMEM液漂洗细胞两次，按感染复数(MOI)值(病毒基因数，v.g./cell)为2 × 104、1 × 105、5 × 105将无血清DMEM培养基与rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP混合液约400 μL加入每孔细胞中，及时混匀。以不进行病毒转染的MSC (MOI = 0)作为对照组，每组设复孔6孔。在37 ℃，体积分数5 % CO2 条件下孵育2 h，弃去培养液，更换新鲜的完全培养基继续在体外进行培养，以后每2 d更换1次培养基。分别于3、7、21 d后在荧光显微镜下观察拍照计数绿色荧光细胞，计算转染效率。每孔通过观察3个高倍视野，采用双盲法计数每100个细胞中的阳性细胞数，取平均值即为其细胞转染率。

　　1.2.2 MTT法检测细胞毒性

　　取第4代MSC，细胞悬液浓度调至1.0 × 103 个/孔，接种于96孔板中，37 ℃孵育过夜，DMEM漂洗两次，按上述MOI值将无血清DMEM培养基与rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP混合液约30 μL加入每孔细胞中，以不进行病毒转染的MSC为对照组，每组设复孔6孔，共分7组。于37 ℃培养箱孵育3 d、7 d，弃培养液，每孔加入完全培养基200 μL，MTT液(5 mg/mL) 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清加入DMSO 200 μL，振荡溶解15 min，于酶标仪上测定490 nm处的光密度D(490 nm)值。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以x ± s表示，采用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，样本均数间比较使用析因设计及单因素方差分析，P < 0.05认为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MSC形态观察

　　48 h更换培养液时，可见散在分布的贴壁细胞，呈梭形，有胞浆突起，少部分呈多角形。第5天见原来的单个细胞或细胞集落形成多个细胞克隆，细胞呈成纤维细胞样，呈平行排列或漩涡状生长。 第10 ～ 12天细胞克隆扩大直至铺满培养瓶底面(图1)。传代培养后的细胞不再以集落方式生长，而呈均匀性分布生长，且生长迅速，约6 ～ 8 d即可铺满全层;第15代以后，形态变平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡，细胞老化，增殖明显变慢。Giemsa染色示第3代犬MSC呈条索状，有长的突足，细胞核较大，核仁明显(图2A)。

　　2.2 MSC超微结构特点

　　透射电镜观察可见，第3代MSC胞体较小，细胞核/浆比例大，胞核呈圆形或椭圆形，核仁明显，胞浆少，染色质较疏松，胞浆中线粒体、内质网等细胞器少，表现出早期细胞的特点(图2B)。

　　2.3 MSC表面抗原检测

　　取第3代MSC进行流式细胞仪检测显示，CD29(95.63 %)、CD44(97.89 %)表达阳性，而CD34(0.41 %)表达阴性(图3)。

　　2.4 rAAV-EGFP对体外培养MSC的转染率

　　荧光显微镜观察示，转染3 d后，rAAV1-EGFP(MOI = 2 × 104)组未观察到MSC表达EGFP荧光;随着MOI的增加，rAAV1-EGFP(MOI = 1 × 105)组及rAAV1-EGFP(MOI = 5 × 105)组个别细胞表达EGFP，但表达EGFP荧光较弱，其转染率分别为(1.2 ± 0.4)%、(4.3 ± 1.4)%。rAAV2-EGFP各组细胞均有表达EGFP，并且随MOI增加，其表达量及表达荧光强度均增强，rAAV2-EGFP(MOI = 5 × 105)组转染率已达(20.3 ± 2.4)%，明显高于rAAV1-EGFP(MOI = 5 × 105)组(P < 0.01)。转染7 d后，各组细胞均表达EGFP，其中rAAV1-EGFP(MOI = 2 × 104)组及rAAV1-EGFP(MOI = 1 × 105)组表达量仍然很低，而rAAV1-EGFP(MOI = 5 × 105)组其转染率达到了(11.8 ± 2.2)%;而rAAV2-EGFP各组细胞此时表达EGFP量明显增加，随MOI增加其转染率分别为(20.1 ± 3.1)%、(43.8 ± 3.4)%、(64.0 ± 5.6)%，明显高于相应MOI的 rAAV1各组细胞(P皆 < 0.05;图4)。连续观察发现随着时间延长，各组EGFP阳性细胞逐渐增多，荧光亮度增强，但增速较慢。到21 d后，表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化。各组rAAV-EGFP转染MSC的转染率见表1。

　　2.5 细胞毒性实验

　　转染3 d及7 d后各组细胞与对照组相比，各组D(490 nm)值差异无统计学意义(P = 0.371，P = 0.471，表2)。

　　3 讨 论

　　3.1 MSC的鉴定

　　目前没有一个特征性的分子能特异性地对MSC进行鉴定。比较一致的标准是：①形态学鉴定，MSC呈梭形外观，贴壁生长;②选取有代表性的、尤其区别容易混杂细胞的表型分子抗体做流式细胞术表型鉴定，结果符合MSC特征;③ MSC具有体外诱导分化为已知细胞的能力。

　　研究结果显示，MSC光镜下形态和Giemsa染色均与成纤维细胞相似，主要为梭形。然而超微结构显示MSC细胞核/浆比例大，显示了干细胞的幼稚特性，与成纤维细胞和血细胞等明显不同。而MSC的这种低分化状态构成了其强大的自我复制和能够向多种组织分化的基础。

　　鉴定MSC表型的表面标志很多，一般认为MSC表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD92、D106、CD120a、CD124和CD166等表面蛋白[7-8]，而不表达CD34、CD38、CD45、CD11a和CD14等。实验结果表明，CD44的阳性表达为97.89%，CD29阳性表达为95.63%，而CD34仅为0.41%。因此，可以认为所获得的细胞是较为均一的的MSC。

　　3.2 不同血清型AAV对MSC的作用

　　AAV载体是最近发展起来的一类新型基因载体，作为病毒载体的重要一员，与其他病毒载体相比，具备如下特性：人群感染率高(80% ～ 90%)，但无致病性，且免疫反应轻微;可定点整合，并能以较稳定的形式存在;宿主范围广泛，包括分裂期和非分裂期的多种细胞;携带的外源基因长期持续稳定表达，并可调控;具有较好的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存[9-10]。因而其在基因治疗中的应用潜力引起了人们极大兴趣。

　　AAV 属细小病毒科家族成员，其颗粒直径18 ～ 26 nm，结构简单无包膜，仅由核衣壳和一条单链DNA构成。国际病毒分类委员会根据衣壳的差异己鉴别出多个AAV种类成员，包括AAV 1 ～ AAV-11等[11-12]。不同AAV血清型具有不同的衣壳构象，因而其识别与结合的细胞表面受体或共受体也相应有差异[13]。

　　形态结构的差异和细胞趋向性的不同导致不同血清型转染的细胞类型和感染效率也各不相同。AAV-1和AAV-7在骨骼肌中的转染效率较高[14-15]，AAV-3在巨核细胞的转染具有优势[16]，AAV-5和AAV-6感染气道顶侧细胞更加高效[4-5]，AAV-8可将基因高效地靶向传递至骨骼肌和心肌[6]，AAV-2、AAV-4和AAV-5均可转导中枢神经系统的细胞，但在感染途径和靶细胞类型上存在差异[17]。

　　AAV对不同动物MSC的转染效率也不同。McMahon等[18]证实AAV对大鼠MSC转染率极低，即使增加病毒滴度也不会增强转染效率;而对兔MSC则有较高的转染率。Chng等[19]对狒狒及人MSC研究发现，AAV对狒狒的转染率明显较人的高，不同血清型的AAV对同种MSC的转染效率也不一样：AAV2 > AAV5 > AAV3 > AAV1、 AAV4、 AAV6、AAV8。McMahon[18]等通过五种不同血清型AAV1 ～ AAV5对兔MSC转染后发现，AAV2的转染效率最高，依次是AAV2 > AAV5 > AAV1 > AAV3、AAV4。

　　本研究结果显示，rAAV2-EGFP各组MSC中均有表达EGFP，并且随MOI增加，其表达量及表达荧光强度均增强，到21 d后，表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化。rAAV-EGFP各组MSC中EGFP的表达明显低于rAAV2各组，即rAAV2对犬MSC的转染效率明显高rAAV1，这与McMahon等[18]和Chng等[19]的研究结果一致，其原因可能为不同AAV衣壳蛋白结构决定簇不同，导致它们同靶细胞表面不同的受体结合，故对细胞的亲嗜性不同。本实验中rAAV2对犬MSC的转染率明显高于兔及人MSC，推测可能与转染病毒的滴度不同及AAV与不同靶细胞表面受体亲和力不同有关，因而对各种宿主MSC的嗜性存在差异。

　　本实验还证实，AAV转染MSC后，EGFP早期表达量较低，随时间延长，EGFP表达率增加较快，推测其原因可能由于AAV是单链DNA，病毒进入细胞后，要变成双链DNA才能进行转录和表达蛋白。这一过程还包括病毒颗粒转运到细胞核内，脱衣壳，正负链退火或单链复制成双链等，因此比较缓慢。有人也把这种第一链合成的过程称为腺相关病毒重组体转染的限速过程。这个过程可以是数天、数星期甚至是数月，这与腺相关病毒重组体转染的宿主细胞及所处的转染环境有关。

　　通过对3种不同MOI值的AAV转染MSC的测定，发现较高滴度AAV的转染效率高，然而有研究显示，也不是MOI值越高越好，当MOI值大于107时，外源基因的表达水平反而会明显下降，甚至几乎检测不到表达。其机理尚不清楚，推测可能与AAV病毒具有多个细胞受体有关。本实验结果显示MOI为5 × 105 v.g./cell较为适宜。

　　通过细胞毒性试验发现，转染3 d及7 d后各组细胞与对照组相比，D(490 nm)无明显差异，说明AAV载体是一种安全、无毒性基因载体。其他研究也证实了这一特点，重组AAV无致畸性，不能诱发恶性肿瘤[20]。

　　综上所述，rAAV2相对犬MSC，其转染效率明显高于rAAV1，可长期稳定表达EGFP，并且对细胞无毒性作用，可作为组织工程种子细胞的理想病毒基因载体。

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