骨髓间充质干细胞对脊髓损伤治疗作用及其机制的初步研究

　　作者：景元海 陈玉丙 聂长春 赵丛然 李恒 郭明峰 范洪源 王强 杨小玉 作者单位：吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 观察骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)对脊髓损伤模型大鼠的治疗作用，为脊髓损伤的治疗提供一种新的治疗途径。方法 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;制备脊髓损伤模型，将BMSCs经尾静脉移植入脊髓损伤模型大鼠体内，观察损伤脊髓病理变化、大鼠行为学变化和Bcl-2、Bax的表达。结果 光镜下观察脊髓病理切片，BMSCs治疗组脊髓较模型组有显著恢复;与模型组相比，脊髓损伤治疗组行为学评分有明显改善(P<0.01);与模型组相比，Bcl-2的表达增多、Bax的表达减少。结论 BMSCs对脊髓损伤模型大鼠有显著的治疗作用。

　　【关键词】 脊髓损伤;骨髓间充质干细胞;修复作用

　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是中枢神经系统的严重创伤，常导致不可逆性的感觉及运动功能丧失。脊髓损伤后形成的巨大囊肿、胶质细胞增生形成瘢痕组织阻碍神经元的再生下行、神经纤维的变形坏死以及中枢神经系统内抑制神经元再生的微环境等因素，极大地阻碍了脊髓损伤的恢复。目前手术、药物、针灸、物理治疗等多种治疗脊髓损伤的方法及近年来出现的脊髓再生的新方法如神经营养因子、神经移植、基因治疗等虽可使成年动物的脊髓功能表现出某种程度的恢复，都不能有效地解决患者截瘫这一难题。随着神经生物学和干细胞技术的发展，使通过细胞移植增加脊髓神经细胞数量、减少胶质瘢痕和空洞的形成成为可能，因此细胞移植有望成为一种有效治疗SCI 的新方法。目前可供选择的移植细胞类型有胚胎干细胞、神经干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞、骨髓间充质干细胞和成纤维细胞等，由于骨髓间充质干细胞(BMSCs)较其他移植细胞具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥反应问题等优点〔1，2〕，因此探讨BMSCs移植治疗SCI 具有重要的临床意义。本研究应用体外分离培养的大鼠BMSCs治疗脊髓损伤模型大鼠，为脊髓损伤的治疗提供一种新的治疗途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康雌性Wister大鼠，体重(220±20)g，24只，购自吉林大学基础医学院。

　　1.2 试剂与仪器 DMEM培养基、胎牛血清FBS ( 美国HyClone 公司)，胰蛋白酶(美国Sigma)，Ficoll-Paque 分离液(美国Pharmacia 公司)，显微镜(OLYMPUS公司)。

　　1.3 脊髓损伤动物模型的建立 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，俯卧固定，行T12椎板切除术。切口以T12为中心，长约3 cm，切开皮肤和肌肉，显露T11～13棘突和椎板，咬除T12棘突和椎板，以脊髓为中心显露大小为3 mm×4 mm的打击区。一手持打击垫，使脊髓接触面垂直紧贴脊髓硬脊膜，另一手将打击架置于其上方，然后手持砝码线调整砝码与砝码接触面的高度为5 cm，松开砝码线进行打击，每只鼠连续打击6次。打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛。术后肌注青霉素20万U/kg体重，每日一次，连续4 d。模型成功21只，实验动物随机分为3组：对照组(正常大鼠，不进行任何处理)，模型组(手术制作脊髓损伤模型)，治疗组〔脊髓损伤手术后注射0.8 ml大鼠BMSCs(1×105个/ml)〕。分别在术后1、7和15 d进行行为学评分，处死取脊髓损伤段福尔马林固定，HE染色，观察损伤脊髓的病理改变。

　　1.4 行为学观察评分 分别在术后1、7和15 d观察动物脊髓损伤程度，按照Tarlov法进行下肢行为学临床评分：0级：后肢和尾部无活动(不包括后肢痉挛);Ⅰ级：后肢和尾部轻微活动;Ⅱ级：后肢和尾部有活动，可带动关节，甚至1肢可站立;Ⅲ级：双后肢可站立，但不能走动，尾部摇摆;Ⅳ级：双后肢可站立、行走，跑则不稳，尾部摇摆或翘起;V级：正常走、跑。

　　1.5 大鼠BMSCs的体外分离培养 将大鼠乳鼠处死，75%酒精浸泡，无菌条件下取股骨，用DMEM 培养液反复冲洗髓腔，200目滤网过滤制成单细胞。加入等体积的Ficoll-Paque分离液，2 000 r/min离心20 min。吸取单个核细胞层加入DMEM培养液，1 200 r/min离心8 min，重复洗涤2 次。用含15%胎牛血清(FBS) 的DMEM培养液重悬细胞、计数，以每孔(2～6) ×106个细胞接种于培养瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培养。接种3 d后换液，可见细胞贴壁。以后每隔4～5 d更换1次培养液。待细胞长满瓶底的80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，见细胞皱缩，加入胎牛血清终止消化，按1∶2进行传代。

　　1.6 免疫组化SP法检测Bax、Bcl-2的表达 每组于手术第1天(24 h)、第7天、第15天处死大鼠，取脊髓损伤部位，固定，切片常规脱蜡水化，加3%H2O2室温10 min，微波抗原修复后滴加正常山羊血清室温封闭20 min，滴加1∶200稀释的单克隆抗体，4℃孵育过夜，再滴加1∶500稀释的二抗，室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染。

　　2 结果

　　2.1 BMSCs对脊髓损伤大鼠治疗后脊髓病理变化 于术后第1、7、15天处死大鼠，取脊髓损伤部位，固定，组织HE染色。镜下观察发现，正常对照组大鼠脊髓灰、白质组织结构完整，神经细胞在灰质中分布均匀、形态正常、尼氏体清晰及细胞膜完整，白质内神经纤维排列整齐，细胞间基质均匀。模型组脊髓组织切片发现损伤区主要位于脊髓灰质。在脊髓损伤1 d可见，损伤区中央灰质出现大片出血、细胞肿胀、尼氏体消失，细胞空泡变性、部分细胞胞核固缩，并有大量单核或多核炎性细胞浸润;7 d脊髓损伤及周围区炎性细胞浸润减轻，有些损伤脊髓组织出现囊腔样变化。术后15 d，病变处出现大片软化灶，仍可见出血灶，神经细胞消失。白质水肿较前减轻，可见胶质细胞增生。经BMSCs治疗后，组织水肿减轻，炎性细胞浸润减轻;空泡变性减轻，神经细胞形态恢复，结构排列完整。第15天神经细胞形态恢复及结构排列较第7天又有改善。

　　2.2 脊髓损伤模型大鼠行为学观察评分 损伤后1 d模型组和BMSCs治疗组均无恢复迹象，运动评分均为0±0，低于正常对照组(6±0);损伤7 d，治疗组大鼠运动功能有所恢复，行为学评分(1.5±0.55)，高于模型组(0.17±0.41)(P<0.01);损伤15 d，治疗组大鼠运动功能进一步恢复，行为学评分(3.17±0.75)明显高于模型组(0.50±0.55)(P<0.01)，但与正常对照组间仍存在差异。

　　2.3 模型大鼠脊髓损伤段Bcl-2、Bax的表达 每组于手术第1天(24 h)、第7天、第15天处死大鼠，取脊髓损伤部位，固定，免疫组化检测Bcl-2的表达。镜下观察结果显示：24 h正常对照组可见Bcl-2少量表达，且细胞着色淡;模型组、BMSCs治疗组均有Bcl-2表达，细胞着色深。第7天模型组Bcl-2持续高表达，BMSCs治疗组Bcl-2阳性细胞数明显增多。至术后第15天，各组Bcl-2表达及着色情况依然表现出此现象。同样，术后24 h正常对照组未见Bax表达，模型组和BMSCs治疗组可见Bax表达。第7天模型组Bax持续高表达，BMSCs治疗组Bax阳性细胞数减少，至术后第15天依然表现出此现象。

　　3 讨论

　　Chopp 等〔3〕采用10 g重物2.5 cm 高度撞击造成大鼠脊髓T9节段损伤，1 w后在损伤中心部位注入2.5×105/ml MSCs，Basso-Beattie-Bresnakan(BBB)评分评价损伤后的神经功能状况。结果发现，所有大鼠的神经功能缺损症状随着时间的推移均有不同程度地减轻，但植入组的情况明显好于对照组。对照组在第3 周神经功能恢复停滞，而植入组持续改善，5 w后植入组已能站立行走，动作十分协调。Hofstetter 等〔4〕对动物损伤的脊髓模型进行MSCs 脊髓内移植，1 w后动物步态明显改善，移植5 w后发现移植区和瘢痕组织区之间可见到新生神经纤维束穿过。本研究结果也证实经尾静脉注射BMSCs 24 h即到达脊髓损伤区血管，经BMSCs治疗后，组织水肿减轻，炎性细胞浸润减轻;空泡变性减轻，神经细胞形态恢复，结构排列完整。第15天神经细胞形态恢复及结构排列较第7天又有改善。而且，损伤7 d，BMSCs治疗组大鼠运动功能有所恢复，行为学评分为高于模型组;损伤15 d，治疗组大鼠运动功能进一步恢复，行为学评分明显高于模型组，提示BMSCs对脊髓损伤有修复作用。林建华等〔5〕将骨髓间充质干细胞经静脉移植对外伤性截瘫大鼠进行治疗，发现骨髓间充质干细胞可向损伤区脊髓聚集并存活，表达神经细胞的表型神经元特异烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、微管相关蛋白2(microbule associated protein，MAP2)，并促进神经结构的修复及神经功能的恢复。

　　间充质干细胞移植对脊髓损伤的治疗作用在不同的实验研究中已得到了证实，但其作用机制仍在研究中。Harvey〔6〕认为MSCs 的营养支持在治疗中起了重要作用。迁移至病变部位的MSCs 同损伤宿主神经组织间的相互作用可导致一些损伤修复因子特别是神经营养因子如BDNF、NGF、血管内皮生长因子等的表达增加。在动物实验中已观察到BDNF、NGF 可减轻损伤脊髓的炎症和保护损伤的神经细胞，减少细胞的凋亡并促进轴突大量再生〔7，8〕。本研究观察到，BMSCs治疗组第7天Bcl-2阳性细胞数明显增多，多于模型组;至术后第15天，各组Bcl-2的表达情况依然如此。而BMSCs治疗组Bax阳性细胞数比模型组少。本实验将进一步研究间充质干细胞进入机体内是否转化为神经元样细胞，神经元样细胞是否有功能等问题。

　　【参考文献】

　　1 Pierdomenico L，Bonsi L，Calvitti M,et al.Multipotent mesenchymal stem cells with immuno-suppressive activity can be easily isolated from dental pulp〔J〕.Transplantation，2005;80 (6)：836-42.

　　2 韩 冰，付小兵.间充质干细胞的研究进展与临床应用前景〔J〕.中国修复重建外科杂志，2006;20(12):1257-61.

　　3 Chopp M，Zhang XH，Li Y，et al.Spinal cord injury in rat：treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport，2000;11(13)：3001-5.

　　4 Hofstetter CP，Schwarz EJ，Hess D,et al.Marrow stromal cells from gaiding strands in the injured spinal cord and promote recovery〔J〕.Prac Natl Acad Sci USA，2002;99(4):2199.

　　5 林建华，雷盛民，康德智，等.静脉注射骨髓间质干细胞对脊髓损伤修复作用的实验研究〔J〕.中华骨科杂志，2005;25(9):556.

　　6 Harvey RL，Chopp M.The therapeutic effects of cellular therapy for functional recovery after brain injury〔J〕.Phys Med Rehabil Clin N Am，2003;14(1 Suppl):143.

　　7 Lu P，Jones LL，Tuszynski MH.BDNF-expressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury〔J〕.Exp Neurol，2005;191(2):344.

　　8 Arthur B，Mary JR，Lynne CW.NGF message and protein distribution in the injured rat spinal cord〔J〕.Exp Neurol,2004;188(1):115.