胶质细胞源性神经营养因子促进脊髓损伤修复的研究进展

　　作者：陈金水，倪斌 作者单位：200003上海，第二军医大学附属长征医院骨科

　　【摘要】脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗是医学界的一个难题，目前还没有很好的治疗方法。大量的动物实验证实，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)有促进SCI修复的作用，为治疗SCI带来了新的希望。本文就GDNF对SCI修复的作用有关研究进展进行综述。

　　【关键词】 脊髓损伤;胶质细胞;神经营养因子;修复

　　Research progress of glial cell linederived neurotrophic factor in promoting　repair of spinal cord injury

　　CHEN Jinshui，NI Bin

　　(Department of Orthopaedics,Changzheng Hospital,Second Military Medical University，Shanghai 200003,China)

　　【Abstract】 There is no good treament for spinal cord injury (SCI).Many experiments have confirmed that glial cell linederived neurotrophic factor(GDNF) can promote injured spinal cord repair.GDNF will be a new method to repair injured spinal cord,especially combined with other methods such as cell transplant,gene therapy.In the review,we summarize the latest research progress on the promotion of spinal cord repairing with glial cell linederived neurotrophic factor.

　　【Key words】spinal cord injury;glial cell;neurotrophic factor;repair

　　脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统的严重创伤，常由交通、劳动和运动等意外事故造成，有报道全世界每年每百万人口有14～40人发生SCI,有些地区甚至高达60例。我国的SCI人数已突破百万。由于SCI患者治疗康复费很高，治疗效果欠佳，给患者家庭、社会带来巨大的负担。目前SCI治疗方法主要有大剂量激素疗法、神经营养因子治疗、基因治疗、手术治疗、细胞移植治疗等,但临床疗效仍不满意。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是近年发现的神经营养因子(neurotrophic factor,NTF),近年动物实验研究表明GDNF在体内和体外都有较强的促进交感、感觉、运动神经元存活和神经元轴突再生的作用。本文就其在SCI修复中的作用作一综述。

　　1 GDNF及其对SCI的修复作用

　　1.1 GDNF及其作用机制

　　GDNF最初是Lin等[1]从大鼠胶质瘤细胞系B49的条件培养液中分离纯化获得。因其结构与所有转移性生长因子β(TGFβ)超家族成员相同，属于TGFβ超家族。广泛分布于全身各类组织[2]。GDNF是通过与GDNF受体结合产生作用的，GDNF家族受体复合物分跨膜酪氨酸激酶蛋白Ret和磷脂酰糖肌醇蛋白(GFRα)，GFRα有GFRα1、GFRα2、GFRα3、GFRα4等4型。GFRα2是必须的存在受体，如果GFRα2缺失，其他的GFRα作用很弱[3]。GFRα1是GDNF的高亲和力受体，能特异性与GDNF结合，而GFRα1本身无跨膜信号传递的功能，跨膜酪氨酸激酶蛋白Ret是作为激活酪氨酸激酶途径的激活物，与GFRα1和GDNF结合的形成的复合物相互作用，引起Ret的磷酸化，激活酪氨酸激酶途径，发挥生物学效应[3-4]。最近，Yoong等[5]发现GFRα1又分GFRα1a和 GFRα1b两型，两型之间有5个氨基酸的差异，这2个亚型在人体的不同组织都有表达。有趣的是，当GDNF分泌时，只表达GFRα1a时会激活ERK1/2,Rac1和Cdc42，促进神经轴突生长。而当GFRα1a和 GFRα1b共同表达时，GDNF则抑制神经轴突生长。这两个GFRα1亚型在神经营养因子通路上起着不同的作用。

　　1.2 对运动性神经元的作用

　　GDNF是目前最强的胆碱能运动神经营养因子。有大量的实验证明：SCI后，GDNF通过转运到达受伤的神经元，保护运动神经元，促进神经元轴突的生长。有报道[6]全身或局部使用GDNF治疗标准的鼠脊髓压迫损伤模型，3周后GDNF治疗组根据BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)评分，鼠后肢运动功能的恢复明显好于对照组。使用免疫组化可以在GDNF治疗组脊髓神经元内可以检测到标记的GDNF,而对照组未检测出。Sharma等[7]报道SCI后30分钟内局部应用GDNF，减缓血脊髓屏障的崩解，水肿形成及细胞损伤，减少脊髓神经细胞的程序性死亡，提高运动功能的恢复。Grumbles等[8]把GDNF等神经营养因子移植入SCI处，10周后观察神经纤维爬行范围，髓鞘轴突数目，诱发肌肉活动。发现GDNF可以促进神经轴突髓鞘化，神经纤维的再生及诱发肌肉活动。在标准的脊髓横断模型，同样使用GDNF治疗，鼠后肢运动功能恢复也明显好于对照组在脊髓的腹侧角和损伤断面均可检测GDNF免疫反应产物染色，表明神经元GDNF表达对损伤有正性调节作用，而远端SCI附近和瘢痕组织未见皮质脊髓束再生，表明横断两端脊髓不可能重新建立连接。运动功能恢复的原因可能是与神经营养因子调节脊髓通路活性有关[9]。Zhang等[10]实验证实了GDNF对神经元有直接的作用，GDNF在体内可以增加再生轴突的数量和使得再生轴突增粗，在体外可以增加背根神经节轴突数量。潘世鹏等[11]蛛网膜下腔置管注入GDNF，观察GDNF对脊髓前角运动神经元的保护作用。发现GDNF组脊髓前角运动神经元的存活率、胆碱酯酶阳性颗粒面积均比对照组有明显提高。Guzen等[12]在鼠脊髓横断模型上，采用坐骨神经移植联合GDNF方法治疗，与单纯的坐骨神经移植比较，发现GDNF增加坐骨神经移植后运动功能的恢复。

　　1.3 对感觉神经元的作用

　　GDNF是体内促进感觉神经元轴突生长发育的重要因子，在胚胎期可以促进感觉神经元轴突的发育，在成熟期可以促进轴突的延长[13]。如果用GDNF长期刺激则可使损伤后再生的轴突返回脊髓并与靶细胞形成功能性连接，恢复感觉功能。有实验表明：SCI后感觉神经元GFRα1过表达，在感觉神经元GDNF受体过表达的动物对热、机械性等刺激的阈值下降，损伤后的感觉神经元对外来的机械性刺激更加敏感。GFRα1的过表达使得损伤后的神经元对GDNF更加敏感,从而可以促进感觉神经元轴突再生[14-15]。移植GDNF成纤维细胞到轴突损伤断端可以促进轴突的再生和髓鞘的形成，在SCI部位可以观察到神经元纤维长过断端，并有髓鞘形成[16]。Chu等[17]在感觉神经移植治疗脊髓根性撕脱伤，预先将GDNF注射感觉神经移植物，与对照组比较，发现注射GDNF的实验组神经元存活和轴突再生明显。损伤部位的对神经纤维数量与GDNF的浓度有关，呈“钟形”浓度相关，并非线性的。在高浓度和低浓度时GDNF作用较弱[15]。尽管成束的神经纤维长过断端，但他们无法完成原来的纤维束的对接，而只是长在脊髓的表面。因此单增强神经元内在生长能力是不够的，脊髓断端的环境仍不允许神经生长，可能存在一些蛋白聚糖或者抑制因子[18]。

　　2 GDNF治疗SCI的应用前景

　　2.1 局部和全身应用

　　GDNF治疗SCI的途径常用的有全身和局部给药。有研究表明[13]通过全身使用GDNF也可以起到一定的效果，GDNF可以通过循环系统和轴突转运到达损伤的神经元，发挥作用，但GDNF血脑屏障的通过率低，疗效有限。所以越来越多的研究者采用局部使用GDNF，观察GDNF对SCI修复的作用时局部使用GDNF，作用直接迅速。Adler等[19]通过鞘内注射GDNF可以促进生长抑素的表达，缓解神经疼痛，提示可以治疗神经损伤引起的长期的并发症。有研究者使用蛛网膜下腔置管，可以持续性使用GDNF，效果好于单次局部使用[11]。Wang等[20]采用聚乳酸聚乙醇酸复合物包裹GDNF,然后通过椎管内注射到SCI周围，因为有聚乳酸聚乙醇酸复合物包裹，GDNF能够持续释放。通过实验表明此方法能够保护神经纤维，促进SCI的恢复。在鼠臂丛损伤模型上，Liu等[21]联合微创手术和局部注射GDNF及NT3治疗脊髓背侧神经根损伤，通过观察这种方法可以避免臂丛神经损伤所致的感觉缺失。联合使用其他神经营养因子，可以取得更好的效果。有实验表明[7]联合使用脑源性神经营养因子(BDFN)和GDNF可以明显减缓脊髓运动功能的障碍，效果更加明显优于单独使用BDNF或GDNF，Madduri等[22]实验发现GDNF和神经生长因子(NGF)在促进神经轴突的分支和延长有协同作用，可能不同的神经营养因子之间有协同作用。

　　2.2 转基因技术

　　随着基因技术的发展，基因治疗技术应用于临床已成为可能。目前很多实验表明可以使用逆转录病毒把GDNF基因转入损伤部位的神经细胞，促使其分泌GDNF，并且可以维持长期分泌GDNF的效果。Tannemaat[23]和Eggers[24]使用慢病毒介导的分泌GDNF细胞，16周后，仍能检测到损伤部位表达分泌大量GDNF,损伤处的神经纤维增加，运动功能恢复，表明慢病毒介导的方法可以长期分泌GDNF,促进损伤感觉神经元恢复，促进运动神经元的恢复和神经轴突的再生。实验结果同时表明，在联合显微外科神经移植时，运动神经元的恢复和神经轴突的再生更加明显。Zhou等[25]研究SCI后,由单存疱疹病毒介导的GDNF对鼠胸髓半切损伤修复的作用,观察后肢的运动情况，4周后后肢运动评分提高有统计学意义。表明单存疱疹病毒有效的转染到脊髓神经元细胞，证实可以分泌GDNF，促进神经突的生长。Ansorena等[26]使用转基因技术，通过哺乳动物细胞细胞系分泌GDNF,相比以往通过大肠杆菌等合成的GDNF,具有较高的纯度，较低的免疫排斥反应，取得疗效也较好。

　　2.3 联合细胞移植

　　目前细胞移植治疗SCI是被看好的治疗方法之一。但由于移植疗效还不是很确切，目前仍处于实验阶段。有研究者[27-29]使用基因技术，把GDNF基因导入移植细胞，然后移植到脊髓。曹莉等[27]使用转入GDNF基因的嗅壳细胞，移植入鼠SCI模型，实验结果表明，与对照组相比，移植入的带有GDNF基因的嗅壳细胞可以增加分泌GDNF，轴突的再生和运动功能的恢复更加显著。Lo等[28]分离纯化和增殖培养分泌GDNF的胚胎源性的NIHSwiss小鼠胚细胞(NIH3T3细胞)在SCI后2小时移植入SCI处，可以分泌GDNF,早期保护脊髓神经元，促进SCI的修复。刘晓刚等[29]对骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子联合移植后，对猴损伤脊髓的皮质脊髓束髓鞘的修复效果进行观察，发现进行干细胞移植，或同时给予神经营养因子可以促进损伤脊髓功能的恢复，GDNF对多种神经元均具有抗损伤的作用。Zhang等[10]GDNF联合雪旺细胞移植可以促进SCI神经轴突再生和髓鞘化。

　　3 GDNF临床应用需要解决的问题

　　大量的实验证实GDNF对于SCI有着很强的修复作用，可以保护神经元细胞，促进轴突的再生，但目前GDNF治疗SCI仍处于临床前的实验阶段，要应用于临床应用还需要解决以下问题：(1)疗效问题，SCI目前临床上仍没有确切的治疗方法，所有的方法都停留在实验阶段，GDNF促进SCI修复的作用，体外实验和动物实验都已经证实，但哺乳动物，甚至人体内实验目前尚未有实验证实，这需要有进一步的实验来证实。单独使用GDNF治疗SCI疗效有限，联合其它方法更有临床应用前景;(2)安全问题，目前使用的外源性GDNF是重组的GDNF,作为治疗用药，其药代动力学、稳定性、溶解度、纯度等问题以及可能机体带来的副作用仍不确定，近期有实验表明外源性的GDNF，由于纯度等问题，可以使机体产生抗体，影响疗效，甚至会交叉反应，对抗自体生成的内源性的GDNF,对机体产生不良的影响[26];(3)剂量问题，GDNF浓度与轴突再生的做用非线性关系，在高浓度和低浓度时GDNF作用较弱[15]。甚至有研究表明超出剂量范围使用GDNF反而阻止外周损伤神经元轴突的生长[30]。

　　GDNF促进SCI修复作用已经得到很多实验的证实，很多学者也采取了不同的途径对GDNF在治疗脊髓方面探索，取得了不少成果，但由于SCI的修复因素很多，单一使用GDNF无法完成SCI的完全修复，目前GDNF对SCI修复的研究还处于实验阶段。GDNF联合应用细胞移植、基因治疗、其他神经营养因子等方法治疗SCI将是今后研究SCI治疗的主要方向之一。

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