异体骨结合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的动物实验

作者:傅明,梁海翔,何爱珊,雷磊

作者单位：中山大学附属第一医院骨科关节外科， 广东 广州 510080 ）

      【摘要】  【目的】 研究使用异体骨混合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的可行性及动物实验初步结果。【方法】 将15只新西兰白兔双侧桡骨造成1 cm骨缺损模型，随机选择同一只动物的一侧为实验侧，自体配对的另一侧为对照侧。将表面脱钙的同种异体骨和来源于受体的体外培养增殖的骨髓间质干细胞混合植入实验侧骨缺损，对照侧仅植入同样制作的异体骨。12周后，进行X线检查、生物力学检查和组织学检查，将结果进行对比。【结果】 动物在术后12周，实验侧X线片光密度测量结果，破坏载荷时扭矩和扭角测量结果均优于对照侧；组织学评分中，实验侧骨痂量评分优于对照侧，骨连接成熟程度和骨髓发育程度两者没有明显差异。【结论】 骨髓间质干细胞可以促进异体骨在移植后的成骨作用，在增多成骨量的同时不影响骨组织发育。

【关键词】  异体骨； 骨髓间质干细胞； 移植； 骨缺损

    Treatment of Bone Defect Bone Allograft with Bone Marrow Stem Cell

    in Animal Experiment

    FU Ming, LIANG Hai-xiang, HE Ai-Shan, LEI Lei, LIN Zi-Hong, SHENG Pu-Yi,

    YANG Zi-bo, LIAO Wei-Ming

    ( Department of Orthopaedics, Joint Surgery, The First Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University; Guangzhou 510080, China )

    Abstract: 【Objective】  To study the feasibility and result of transplanting bone allograft with bone marrow stem cell in treatment of bone defect in animal experiment. 【Methods】  Fifteen New Zealand white rabbitswere chosen for the 1 cm bone defect model of both radiuses. Randomly, one radial side was chosen for the model, and the other side was for the control one. The bone defect of experimental side was filled with surface-demineralized bone allograft and bone marrow stem cell cultured in vitro. The control side was filled with bone allograft only. After 12 weeks, all the animals were observed by X ray, biomechanics, and histology. The results were analyzed and compared. 【Results】  After 12 weeks, the X ray density, the torsional moment and angle in failure load test and the score of callus in histological grading were all improved in the experimental side, compared with the control side. There was not statistically significant difference in both mature degree of bone union and growth degree of bone marrow. 【Conclusion】  Bone marrow stem cell can enhance the osteogenesis of bone allograft after transplantation, which increases the bone formation without affecting the development of bone tissue.

    Key words:  allergenic bone; bone marrow stem cell; allograft

    [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（5）:515-519]      骨移植是治疗骨缺损最主要的方法，同种异体骨以其生物学特性和形态结构与自体骨相近，可以长期保存等优点而已广泛应用于临床，但大段异体骨移植后，由于骨融解吸收的速度快于新骨形成，影响了大段异体骨结构性骨移植的远期疗效。已有实验证实骨髓间质干细胞（bone marrow stem cell，MSC）在一定诱导因素作用下能向成骨细胞分化，促进成骨[1,2]，但将异体骨和骨髓间质干细胞混合移植后的效果如何，目前未见报道。本研究应用异体骨混合骨髓间质干细胞植入动物体内进行实验性探索，希望通过骨髓间质干细胞的成骨作用，达到改善治疗效果的目的，为临床提供参考。

1   材料和方法

    1．1   实验动物

    健康新西兰白兔15只，雌雄不限，体质量2.8～3.5 kg，平均为3.1 kg，兔龄5～10(S=7)月。

    1．2   实验试剂和材料

    低糖型DMEM干粉培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）：13.75 g/包（美国Gibco公司）。胎牛血清（FBS；美国Hyclone公司）。0.25％胰蛋白酶（美国Sigma公司）。淋巴细胞分离液（天津TBD生物技术中心）,密度为1.077。PBS平衡盐溶液（美国Hyclone公司）。青霉素－硫酸链霉素双抗溶液：青霉素1万 U＋链霉素10 mg/mL（美国Gibco公司）。异体骨：从健康5月龄新西兰白兔桡骨截取。

    1．3   异体骨的制备

    从5月龄的健康新西兰白兔双侧取出桡骨，截去两段干骺端后得到直径均匀的长约5 cm的骨段，将每段骨截成3段各长约1.5 cm的骨段，在充分清除骨髓和软组织后，先用三氯甲烷 ∶ 乙醇=1 ∶ 1的溶液浸泡24 h进行脱脂；用0.6 mol/L的盐酸浸泡15 min进行表面脱钙；用PBS溶液冲洗后，再用PBS溶液，37 ℃浸泡24 h中和盐酸；测定浸泡后的溶液pH值约为7.0～7.2后，用超纯水250 mL+青霉素10万U+庆大霉素8万U+链霉素100 ?滋g浸泡24 h，然后在超净台内晾干。将上述处理的异体骨分别装入2 mL的冻存管内密封，在－80 ℃下深度冰冻2周；然后用2.0 Mrads剂量的γ射线照射12 h灭菌。再放入－80 ℃下深度冰冻保存备用。使用时，将异体骨放入约37 ℃的PBS中浸泡解冻后使用。

    1．4   细胞培养

    对于骨髓间质干细胞的制备、原代培养和保存方法，具体见参考文献［3］。

    1．5   动物实验

    将15只5月龄新西兰兔随机选择一侧桡骨植入已经制备好的异体骨；另一侧桡骨植入制备好的异体骨和自体来源的经过培养增殖的骨髓间质干细胞。手术后每只动物单笼伺养，定期观察。

    手术方法和步骤：剥离桡骨中段骨膜约长1.2 cm，锯断并取出1.0 cm长桡骨，造成骨缺损，并用刮匙刮除骨断端各约0.5 cm的骨髓腔内的骨髓组织。将随机选择的一侧作为实验侧，在桡骨缺损处植入上述已制备好的异体骨，然后用1 mL注射器吸出事先准备好的骨髓间质干细胞混悬液，在植入的异体骨髓腔内注入0.5 mL细胞混悬液。不作内固定，逐层缝合肌间软组织和皮下组织。将注射器针头穿过软组织刺入植骨周围的间隙内，将剩余的0.5 mL细胞悬液注入植骨周围的间隙。缝合皮肤，关闭切口。将另一侧桡骨缺损处同上方法植入异体骨，但不加骨髓间质干细胞悬液，作为对照侧。

    1．6   观察方法

    ①症状和体征观察：包括动物术后伤口情况和肢体功能恢复情况。②X线照片检查：在术后12周时对白兔行X线照片检查。X线片结果利用图像分析系统进行灰度测试，达到半定量测量。③生物力学检查：在第12周时，用空气栓塞法处死动物，取出双侧桡骨，剔净附丽的软组织。将桡骨截取包括手术区域的一段长约4 cm的骨段，将截取的骨段两端包埋，在生物力学测试机上进行扭转应力测定，电脑记录破坏扭矩和扭角。④组织学检查：将生物力学检测前的桡骨，按照骨缺损修复形态学标准进行评分。在生物力学检测后的桡骨上异体骨和自体骨交接处截取一段长为0.8 cm的部分进行纵行切片。10%福尔马林浸泡固定后，脱钙、石蜡包埋、脱水，HE染色后进行光镜下检查。参照Nilsson等提供的方法建立组织学评分标准(表1)。

    1.7   统计方法

    用SPSS10.0软件进行统计处理，计量资料采用配对两两样本的t检验进行处理，计数资料采用配对设计差值的符号秩和检验（Wilcoxon法）。

综上所述，异体骨结合骨髓间质干细胞移植能够达到促进异体骨成骨的目的，这种作用主要是通过增加局部或骨量来实现的，植入的骨髓间质干细胞使局部形成较多的自源的骨性组织，当异体骨逐渐被受体动物吸收后，这些新形成的骨质可以在局部提供较多的力量支持和维持一定的体积［13］，不仅一定程度适应了肢体活动的需要，而且维持一定骨的形态，有利于以后进一步的骨质修复。这种方法可以为临床提高异体骨远期疗效提供帮助。2   结   果

    2．1   细胞培养结果

    实验中观察到，MSCs在接种到培养瓶后24 h，大部分细胞贴壁，多呈圆形，在倒置显微镜下折光性较强。48 h后，部分细胞开始出现多形性变化，呈现出多角样、椭圆形和短梭形；部分细胞开始呈巢状生长。在培养初期的2～3 d内，细胞变化缓慢；其后，细胞增殖加快，尤其在细胞较密集处，增殖和变形较明显。6～12 d为细胞快速增殖期，此时仍以短梭形细胞为主，但是，部分细胞开始逐渐变成长梭形。培养12～14 d左右，细胞铺满瓶底，呈现类似成纤维细胞样的长梭形。此时细胞表现为典型的“鱼群样”聚集（图1）。第一次传代后，培养24 h，可见细胞大部分贴壁，部分细胞开始变形。传代后细胞生长和增殖速度加快。培养7 d后，细胞呈长梭形，可以铺满培养瓶底。此时，细胞生长表现为旋涡状生长，分布均匀（图2）。

    2．2   动物大体观察

    所有实验动物均得到有效观察。植骨手术后所有动物觅食正常，活动能力相似，伤口无滲出，肿胀程度轻。所有切口得到一期愈合，术后两周伤口缝线自行脱落。术后12周，取出桡骨后，见到实验侧和对照侧的桡骨均得到骨性愈合。实验侧骨痂生成量较对照侧多。实验侧可见到植入的异体骨周围生成明显的骨痂和骨桥，骨质较硬。对照侧虽然也达到骨性愈合，但是，异体骨植入区骨量较另一侧少，骨痂生成也较少（图3）。

    2．3   X线检查结果

    在动物饲养12周时，行X光检查，见实验组骨折断端骨质生长良好，有连续性骨痂通过骨折断端，骨折线模糊至消失；对照组也见有骨痂生长，但部分骨折断端仍可见透亮线（图4）。检查结果用JVC ky-F30B 3-CCD彩色图象摄录输入仪输入德国产KORTRON IBAS 2.0全自动图象分析系统测量光密度。同一只动物双侧肢体为配对样本，测量相同长度（包括手术植入异体骨部位和两端的一段自体骨）的骨段，结果为：实验侧光密度均值为1699.3±305.3，对照侧均值为(1510.4±281.4），t＝2.292， P< 0.05（表2），提示光密度的总体均数不等，实验侧比对照侧骨量更多。

    2．4   生物力学检查结果

    将同一只动物双侧桡骨作为配对样本，在美国产MTS 858 mini Bionix生物材料试验机上测量破坏扭矩和扭角，结果为：实验侧扭矩均值为(0.243±0.018) Nt/m,对照侧均值为(0.179±0.025) Nt/m, t=3.064, P< 0.01（表2），提示实验侧骨的强度更好；实验侧扭角均值(21.056°±2.262°),对照侧均值(15.007°±0.964°), t=2.413, P< 0.05（表2），提示实验侧骨的弹性更好。

    2．5   组织学检查结果

    组织学由病理研究人员根据表1的方法评分，评分结果为：骨组织连接情况实验组23分，对照组23分；骨髓腔情况实验组18分，对照组17分；骨痂生长情况实验组28分，对照组20分。结果用配对设计差值的符号秩和检验（Wilcoxon法）进行统计分析,结果显示，实验侧与对照侧骨组织连接：T=0.333, P >0.05,差异没有显著意义；实验侧与对照侧骨髓腔情况：T=0.816, P >0.05；实验侧与对照侧骨痂生长情况：T=2.111, P< 0.05（图5）。

    3   讨   论

    3．1   骨髓间质干细胞在修复骨缺损中的作用

    MSC是一种来源广泛，获取容易，能在体外培养得到大量增殖并保持成骨活性的细胞[2,3]。本实验根据MSC的这些特点，利用MSC具有的分化成骨的能力，将MSC作为种子细胞植入动物体内，在局部促使其转化为成骨细胞，形成新的骨质，填补缺损，最终达到修复骨缺损的目的。

3．2   骨髓间质干细胞成骨的环境

    MSC向成骨细胞分化需要在一定的环境中，在一定的诱导因素存在下进行。干细胞存在的微环境称为“干细胞壁龛”[4-6]。本实验通过提供骨髓腔和骨周间隙为MSC生存和分化的微环境，利用异体骨和自体骨中诱导骨生长的BMP、TGF－β、bFGF等为诱导因子，使MSC获得向成骨细胞分化生长的有利环境。实验表明，在上述环境中，MSC通过分化为成骨细胞等方式，促进了成骨。研究表明，局部MSC浓度要超过2×107/cm3才能确保新骨形成，本实验使骨髓腔和骨周间隙MSC细胞浓度接近2×108/cm3，手术野的出血形成血肿，将植入的MSC包裹，使MSC局限于术野置入的异体骨周围。

    3．3   异体骨的作用

    本实验采用特殊方法处理异体骨，降低了异体骨的抗原性的目的，使异体骨在植入受体体内后，免疫反应引起移植失败的可能性得到较大程度控制。实验中，在对异体骨采用表面脱钙，表面脱钙可以使异体骨中的BMP等骨诱导因子部分暴露，促进成骨；同时保持了异体骨具有一定的机械强度[7，8]。表面脱钙后，在骨质表面（包括骨外壁和骨髓腔内壁）形成一层胶原样结构，有利于吸附植入的MSC细胞。实验中，异体骨还在植入前经过抗菌素溶液浸泡、γ射线照射等处理，避免了感染影响植骨的效果。研究发现，γ射线照射的剂量在2 M rads，时间达到12 h能够杀灭包括芽孢在内的所有细菌。经过上述的处理使得异体骨在植入受体之前达到完全无菌，较低的抗原性又保持了一定的外形和机械强度，适合作为修复骨缺损的组织工程材料［9］。

    3．4   骨髓间质干细胞与异体骨结合治疗骨缺损的效果和意义

    本实验显示，实验侧异体骨植入体内后达到骨性愈合。其成骨作用不仅发生在异体骨和自体骨连接处，而且在整个植骨区域都可以观察到不同程度的新骨形成。由于手术中植入异体骨周围的MSC是在缝合骨周软组织后，穿过软组织注射到异体骨周围，可以在一些大体标本观察到部分区域形成隆起较明显的骨痂。这种现象可能是在穿刺部位形成的针道中残留的MSC成骨作用的结果。这表明MSC有很好的成骨效果。纵行剖开骨质后，可以见到植入的异体骨与自体骨之间的分界不明显，部分样本在骨髓腔内形成红骨髓样成分，部分样本的异体骨骨髓腔未完全再通。在骨皮质外壁和骨髓腔内壁都可以见到类似软骨样物质，说明存在软骨成骨作用。对照侧，也全部达到骨性愈合，但骨痂主要分布在异体骨与自体骨连接处，骨痂的量也较实验侧少。纵行剖开骨质可见到大部分骨髓腔未再通，红骨髓样物质也较实验侧少。通过大体标本观察可见实验侧比对照侧形成的骨痂多，而且分化程度更成熟。

    对标本行X光照片后，通过图像分析系统测量其光密度可以半定量测量骨密度的强弱。从实验结果可以看到：实验侧结果的均值比对照侧高，实验侧与对照侧有显著性差异。表明实验侧平均骨密度较对照侧高，成骨量较对照侧多。说明MSC植入后成骨，促进了骨缺损的修补。

    在生物力学试验机上测量标本的扭矩和扭角，可以了解成骨后骨质的强度和弹性。扭矩为在做扭转应力试验时达到骨质破裂的所需力矩。扭矩越大，骨质强度越大，达到骨折时所需力矩越大。扭角为扭转应力试验中达到骨质破裂时，骨质两端围绕中轴线相对旋转的角度差值。扭角越大，骨质抗扭转的能力越强，弹性越好[10-12]。实验结果可见实验侧的扭矩的均值和扭角均值均比对照侧高，差异有显著性。说明实验侧不仅成骨量比对照侧多，而且形成的骨质强度比对照侧高，弹性更好。

    组织学观察，对照侧与实验侧在组织连接程度和骨髓腔再通程度上差异不明显，但骨痂量差异显著。组织连接程度和骨髓腔发育程度反映了新形成的骨质的成熟程度，两者之间差异不显著。说明植入的骨髓间质干细胞发育速度和成骨速度与动物体内的细胞相类似。骨痂量的差异可以看出实验侧主要通过成骨量增加达到增大骨强度的作用。

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