肾缺血再灌注损伤后Hepcidin的表达及临床意义
发表时间：2014-12-17 浏览次数：1639次
肾缺血再灌注损伤(IRI)是临床常见的病理生理变化,常见于器官移植、急性失血等过程.Hepcidin是来源于肝脏的一种体内铁稳态调节剂,其表达与机体贫血、缺氧和炎性反应有关.缺血性肾衰、肾移植术后均存在肾脏缺血再灌注过程,从而产生缺氧、失血和炎性反应.我们通过观察对大鼠肾缺血再灌注损伤后肝脏Hepcidin的表达变化,以及和血清Hepcidin、白细胞介素(IL)-6、血肌酚(Cr)等指标的相关分析,探讨Hepcidin在肾缺血再灌注损伤中的临床意义. 一、材料和方法 1.实验动物和分组:选用健康雄性SD大鼠40只,体质量160一210g随机分成对照组(C组)10只,缺血再灌注组(IR组)30只,IR组按再灌注的不同时相分为6,24,48h3个亚组,每个亚组10只. 2动物模型建立与标本采集:3%水合氯醛(10ml/kg)腹腔注射麻醉,做腹部正中切口,切除右肾,分离左肾动脉,用无创动脉夹夹闭,可见肾脏变为暗红色,说明夹闭成功.45min后松开动脉夹,肾脏由暗红色变为鲜红色,说明再灌注成功.对照组开腹后切除石肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉于再灌注后6,24,48h处死大鼠,处死前下腔静脉采血4ml,取新鲜肝脏冻存于一800C冰箱保存3.半定量逆转录一聚合酶链反应(SqRT-PCR)法测定肝脏Hepcidin的mRNA表达:(1)RNA抽取:将大鼠肝脏组织,依次加人Trizol试剂、氯仿、异丙醇,75%乙醇,通过一系列操作得到总RNA.(2)逆转录:样本取5p,1RNA,依次加人Oligo(dT)1p,1,5x反应缓冲液4wl,Rnase抑制剂1p.1,10mmol/LDntp混和物2闪,M-MuLVRT1闪,以总RNA为模板逆转录获得.DN,4,逆转录条件:42℃60min,70汇5minRT试剂盒购自美国Fermentas公司,产品编号:#h1622(3)PCR:取.DNA3p1,加人Hepcidin上下游引物或甘一油醛一3一磷酸脱氢酶(GAPDH)上下游引物各1p,1,PCRSuper混和物45闪,进行PCR反应获得DNA,PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃20s,55℃20s,720C15s,循环30次,72℃延长5min二引物序列见表1-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司,产品编号:C10572-014,(4)电泳:取少量获得的DNA做琼脂糖(1%浓度)电泳获得Hepcidin和G.APDH条带,通过计算机成像分析,获得RT-PCR结果电泳图像用Imagepro-plus生物电泳图像分析软件进行半定量分析4.大鼠血清Hepcidin测定:用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂真空管在处死大鼠下腔静脉取血4n>1,4℃,3000r/min,离心10min,分离出血清,置一80℃冰箱保存采用竞争性同相酶联免疫分析法(ELISA)测定标本l(11.清Hepcidin含量,试剂盒为美国RayBiotech公司(产品编号:DRE20097).实验操作按说明书进行,检测范围:I一20L/L. 5.大鼠血清IL-6测定:方法同血清Hepcidin测定~试剂盒为美国RayBiotech公司(产品编号:DRE20064).实验操作按说明书进行,检测范围5一100μg/L. 6.生化指标测定:采用全自动生化仪检测大鼠Cr的含量. 7,大鼠肾脏组织形态检测:将固定于10%中性福马林溶液中的大鼠肾组织行石蜡包埋,切片,常规行苏木素一伊红(HE)染色,光镜下观察对照组和不同缺血再灌注时间组的肾组织病理变化. 8.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,各数据用均数士标准差来表示.两组间比较用t检验,多组间比较用方差分析,关联分析采用Pearson相关分析. 二、结果 1.肾缺血再灌注不同时相病理形态学改变:对照组:未发现明显异常,6h组可见近曲小管上皮细胞肿胀,颗粒样变h"};24h组近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死,可见断裂的基底膜,管周血管明显扩张淤血.间质充血,有炎性细胞浸润;;48h病变均较24h组减轻,变性有所减轻2.SqRT-PCR检测肾缺血再灌注后肝脏组织HepcidinmRNA的表达:对照组中Hepcidin的SqRT-PCR电泳条带灰度Hepcidin/GAPDH的比值为(0.62士0.76),IR组中不同时相Hepcidin的SqRT-PCR电泳条带灰度Hepcidin/GAPDH的比值分别为0.63士0.03,1.28土0.15,0.64士0.07:对照组与IR组中24h组的密度比值差异有统计学意义(P<0.05),IR组中24h组较61,组48h组的密度比值也有统计学意义(P<0.O5). 3.肾缺血再灌注后各组资料的比较:见表2. 4.肾缺血再灌注后血清Hepcidin的表达与IL-6、肌醉的相关分析:见表3三、讨论 1RI指组织缺血一定时间后血流重新恢复,细胞结构破坏和功能代谢障碍加重,器官功能恶化的综合征肾脏对缺血再灌注很敏感,肾缺血再灌注不仅是急性肾功能衰竭的重要损伤环节,也是肾移植过程中影响移植肾早期功能恢复及长期存活的因素肾脏IRI产生的自由基和氧化应激分子在损伤的病理生理中发挥着重要作用,而铁代谢是自由基产生损伤的关键因素最新研究结果显示肝细胞合成和分泌的Hepcidin在机体铁代谢中起重要的调节作用,它通过减少小肠对体外铁的吸收,以及减少网状内皮系统巨噬细胞对体内铁的释放,在铁代谢中起到核心调控作用"我们观察了肾脏IRI对大鼠肝脏Hepcidin和血清Hepcidin表达的影响,以及伴随的炎性反应和生化改变,分析Hepcidin对机体铁代谢的影响和Hepcidin与IL-6、血肌醉的相关性. 本实验通过构建大鼠的肾缺血再灌注模型,在不同再灌注时间检测肝脏HepcidinmRNA和血清Hepcidin的表达,结果显示:(1)Hepcidin的表达IR组较C组有明显增高,差异有统计学意义.(2)Hepcidin表达和再灌注时问有关,不同再灌注时间点比较差异有统计学意义,随着再灌注肾脏损伤加重,Hepcidin表达越高,24h肾损伤最严重,Hepcidin表达也最高有研究认为肝脏缺血再灌注后Hepcidin的表达较对照组差异有统计学意义L=肾脏的IRI对于肝脏Hepcidin的表达同样具有影响,可能肾脏IRI产生的失血、缺氧和炎性反应会对体内的铁代谢会造成影响,引起体内铁平衡稳态的改变我们已经发现慢性肾功能不全导致的炎性反应可促进Hepcidin的增高,而促炎因子IL-6在调节Hepcidin的表达起主要的作用其作用机制可能是通过与信号传导及转录活化因子3(S1_aT3)的结合,从而激活Hepcid的转录活化因子,通过酪氨酸激酶(J}Kj/s'rsT信号转导通路使得Hepcidir,的合成增加异(3)通过ELIS1法测定两组大鼠的IIIL青工L-6水平,发现川组较(:组的皿清丁L-6表达明显升高.旅异有统计学意义(-I)在IR组中ILL寿II_-6与ii!I清Hepcidin,肝脏Hepcidin表达f1J相关性分析中可以发现,爪清IL-6与肝脏Hepcidin表达以及血清hepcidin呈正相关,说明在肾脏IRI中IL-6可能是调节Hepcidin表达的重要因素可能是肾脏的缺血再灌注引起缺氧、失1111\炎陀反应,通过IL-6的J}h/丁、T信号转导通路从而调控肝脏的Hepcidir:表达最近的研究认为Hepcidu,可作为急性肾损伤氧化应激反应游离铁代谢的标志物ia!,、本实验结果显示肾脏IRI后的Hepcidin升高,表明Hepcidin在肾缺血再灌注中的表达有着重要的临床意义,可以作为肾损伤反应的指标LSPr'OWi.等fi的研究表明指出在心肺转流术后发生的急性肾损伤,检测尿Hepcidin和尿Hepcidin/Cr,发现结果明显降低,并且和没有发生肾损伤的患者差异有统计学意义,从而认为检测Hepcidi},可作为急性肾损伤的早期诊断和采取干预措施的指标(1)本研究结果显示血清C:的表达和Hepcidin的表达呈正相关随着肾脏再灌注损伤的加重,血C:和Hepcidin的表达都呈增高的趋势,而24h达到最高峰说明在IRI过程中,肾脏发生一系列失血、缺氧、炎症等病理生理改变,刺激了Hepcidin的表达,并且与肾脏的损伤程度有关.(2)随着肾功能的恢复,Cr和肝脏Helwidin都呈持续性下降,表明肾脏对Hepcidin有一定的代谢作用,通过肾脏的排泄作用,减少了Hepcidir,的表达(3)我们研究表明Hepcidin可作为一种反映肾脏IRI程度的标志物肾脏IRI作为一种急性的肾损伤,发生了一系列复杂的过程,影响机体铁代谢的平衡,从而改变机体的代谢.最新研究,Ho等7{研究表明表达降低的尿Hepcidin可以作为急性肾损伤的预测因子而我们的实验分析了肾脏IRI后肝脏Hepcidin的表达,以及血清Hepeidin,IL-6,Cr的相关,发现Hepcidin的表达与肾脏IRI有一定关系,可以作为分析脏IRI的标志物. 参考文献 Malyszko J,Mysliwiec M. Hepcidin in anemia and inflammation in chronic kidney disease[J].Kidney and Blood Pressure Research,2007.15-30. Goss JA,Seu P,Gao FQ. Ischemiareperfusion of rat liver modulates hepcidin in vivo expression[J].Liver Transplantation,2005.800-806. 许贤林,何小舟,徐宁. 不同程度肾性贫血患者血清Hepcidin水平的变化[J].中华肾脏病杂志,2011,(12):933-934.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-7097.2011.12.014. Verga Falzacappa MV,Vujic Spasic M,Kessler R. STAT3 mediates hepatic hepcidin expression and its inflammatory stimulation[J].Blood,2007.353-358. Ganz T,Nemeth E. Hepcidin and disorders of iron metabolism[J].Annual Review of Medicine,2011.347-360. Prowle JR,Ostland V,Calzavacca P. Greater increase in urinary hepcidin predicts protection from acute kidney injury after cardiopulmonary bypass[J].Nephrology Dialysis Transplantation,2011.387-390. Ho J,Reslerova M,Gali B. Urinary hepcidin-25 and risk of acute kidney injury following cardiopulmonary bypass[J].Clin J Am Soc Nephrol,2011.2340-2346.
