利用RelB小干扰RNA沉默的树突状细胞预防急性排斥反应

最新研究表明,直接阻断树突状细胞(DC)成熟的核因子(NF)-KB信号,体外诱导出耐受性DC,使DC在体内外多种刺激因素作用下均低表达共刺激分子,从而诱导移植免疫耐受,取得了一定的效果.从目前已报道的方法看,虽然均能有效阻断NF-KB信号,抑制DC成熟,诱导出耐受性DC,但NF-KB在DC分化、成熟、存活等方面都是主要的信号调控因子,如果完全阻断NF-KB信号通路,不可避免地将影响DC分化及存活,从而降低其诱导T细胞免疫耐受的能力.　　我们利用这种方法靶向抑制DC的ReIB亚基活性,试图建立新的耐受性DC.　　材料与方法　　1.材料:6一8周龄,SPF级的C57BL/6(H-2Kb),C3H小鼠,BALB/C小鼠来源于武汉大学医学实验动物中心,动物在武汉大学人民医院动物中心饲养,RM-1细胞来源中国科学院上海细胞库,细胞在RPMI1砂.完全型培养基+10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100mg/I链霉素,370C,5%CO2湿化培养箱中培养.实验所用抗体来源于Ebioscience公司.　　2慢病毒获得和耐受性DC制备:遵照前期研究结果获得RelB小十扰R}}A(siRN}})慢病毒载体,小鼠骨髓来源的DC通过取小鼠股骨,胫骨骨髓细胞在富含20},g/L粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),10}g/L自细胞介素-4(1L})培养基中培养7d获得一3几实验分组,未成熟组((imDC组),将获得的骨髓来源的DC(bmDC)持续培养,避免脂多糖(LPs)等外源性刺激;成熟DCs组(mDC组),将获得的bmDC进行培养,在第7天用I,PS刺激成熟;干扰载体对照组(LueRsiRN}}1组),将获得的1mDC进行培养,于第5天感染十扰对照载体LucR-siR\慢病毒,至第7大经LP5刺激成熟;ReIBsiRNADC组,将获得的ImDC继续培养,于第5天感染ReIBsiR\1慢病毒颗粒,至第7天经LPS刺激成熟万所有慢病毒感染DC的转染复数(MOT)值为5,刺激DC成熟的LPG浓度为50g,DC感染慢病毒96h后经流式细胞仪检测荧光表达.　　3.Re1BsiRNA转染DC体外诱导同种T细胞抗原特异性低反应性:取7一8周龄的BAIiT}/C小鼠,分离脾脏并研磨,制成单细胞悬液,以尼龙毛柱进一步分离出T细胞,作为反应细胞二收集上述-1组I>(:,作为刺激细胞二刺激细胞与反应细胞(5x10,个)按1:50,1:100,1:200不同比例混合培养于96孔板,单纯T细胞培养作为阴性对照4d后,按照细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒操作说明,将CCK-8溶液(10浏/孔)加到各组细胞培养液中,再培养3h酶标仪检测450nm处的各组吸光度值细胞抗原特异性低反应性分析:上述各组细胞混合淋巴细胞反应(V1LR)后,尼龙毛柱分离反应1'细胞,收集C57B1./6和C3H小鼠培养12dDC作为刺激细胞,行第2次}'ILR后,CCK-8试剂盒检测反应T细胞在具有特异性抗原的C57BI,/6小鼠DC和非特异性抗原的C3H小鼠DC刺激下的增殖能力.　　4.Re1BsiRNA转染DC诱导同种抗原特异性T细胞凋亡:制备各组C57小鼠来源DC作为刺激细胞和BALB/C小鼠来源的T细胞作为反应细胞在24孔板中,每孔接种反应细胞2x106个和刺激细胞1/105个,孵箱培养4d收集细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)重悬,再加人5闪膜联蛋自\:(AnnexinV)和5闪碘化丙锭(PI),流式细胞仪检测.　　5.CD4十CD25十叉状头/翅膀状螺旋转录因子(I'oxp3)调节性T细胞测定:_上述各组C57小鼠DC与BALB/C鼠T细胞作MLR后,用藻红蛋白(I'F.)标记的CD4单抗,异硫氰酸荧光素(F1TC)标记CD25单抗,藻蓝蛋白、APC.记的Foxp3单抗进行染色,流式细胞仪分析CD4'CD25十Foxp3十调节性T细胞(Treg)数量变化.　　6.供体Re1BsiRNA转染DC诱导同种异体小鼠心脏移植免疫耐受:根据Masanori的方法建立同种异体小鼠心脏移植模型:供体为C57BL/6小鼠,受体为BABL/C小鼠、实验分组:共4组,每组10只,输注细胞5x10"个:末输注组:受体BABL/C小鼠心脏移植前后无任何特殊处理;imDC组:受体B:}1BL/C小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注培养6d但未作其他处理的DC;LucRsiRNA组:受体BABL/C小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠空载体转染DC;Re1BsiRN:}组:受体BABL/C小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C_57BL/6小鼠Re1BsiRNA转染DC;移植心存活时间:术后每天经腹部触摸移植心脏的搏动,直至移植心脏完全停跳,计算移植心脏的存活时间.　　7.病理学检查:术后的第7天各组随机抽取3只小鼠,取移植心脏做病理切片,行苏木素一伊红(HE)染色观察排斥反应程度,采用国际心脏与肺移植协会的心脏移植排斥反应分级2004年修订版标准》对移植心脏排味行分级诊断8,统计学方法:应用sPSS18.0统计软件分析计量结果以均数士标准差表示,两组间比较采用配对t检验结果1.而寸受性DC刺激T细胞增殖能力:较mDC组和LucRsiRNA组,imDC组和ReIBsiRNA组DC刺激同种T细胞增殖能力明显减弱mDC组、LucRsiRNA组、imDC组DC诱导的同种T细胞对相同特异性抗原(C57小鼠DC)和第3方抗原(C3H小鼠DC)均有明显增殖反应,而ReIBsiRNA组DC诱导的同种『T细胞对第3方抗原有明显增殖反应,但对相同特异性抗原呈明显低反应性,说明Re1BsiRNA转染DC能诱导同种T细胞抗原特异性低反应性(图1).　　2.耐受性DC诱导的同种抗原特异性T细胞凋亡和Treg产生:较mDC组,ReIBsiRNAL1C诱导抗原特异性T细胞凋亡增加,同时T细胞分化为CD4'CD25'Foxp3'Treg比率增加.　　3.移植心脏存活时间和病理学检测:经Log-Rank检验,imDC组与其他两组比较移植心脏存活时间显著延长(P<0.05);而Re1BsiRNADC组移植心脏存活时间比imDC组显著延长(P<0.05)术后7d未输注组和LueRsiRN_4组移植心脏肿胀,颜色暗红,与周围组织粘连严重显微镜下见弥漫性的淋巴细胞浸润、伴心肌出血、坏死,排斥反应分级为Grade-m级.imDC组移植心脏肿胀,颜色稍红,与周围组织粘连较轻.显微镜下见多灶性的淋巴细胞浸润、伴心肌细胞水肿,排斥反应分级为GradeI一I(级ReIBsiRNADC组移植心脏颜色红润,与周围组织粘连少显微镜下仅见散在的淋巴细胞浸润,未见心肌坏死,心肌结构完整,排斥反应分级为Grade0一I级.　　讨论　　许多前期研究已显示耐受性DC可以诱导移植免疫耐受,延长移植物存活,降低排斥反应"一阻断DC中NF-KB功能可获得耐受性DC}e,但NF-KB有5种蛋白(亚基):RelA(p65),Re1B,c-Rel,NF-KB1(p50),NF-KB2(p}2)oNF-KB各亚基的基因及蛋白质结构、DNA结合序列(KB位点)不同而具有不同的功能6通过基因敲除技术,目前已逐渐明确ReIB调控DC成熟.RelB一小鼠具有正常的外周imDC,但缺乏成熟的髓系DCoDC共刺激分子表达由NF-KB的ReIB亚基调控,而其分化和存活则依赖于其他亚基的活化,若单独抑制NF-rcB中的ReIB表达将能有效的抑制DC成熟,而不影响DC的分化,生存等其他功能,从而获得稳定的耐受性DC,我们利用RelB沉默的DC同T细胞进行混合淋巴细胞反应时能够有效的抑制T细胞的增殖,而对第3方抗原来源的T细胞仍表现出刺激增殖能力,诱导1,细胞凋亡,这说明Re1B沉默的DC能诱导抗原特异性T细胞耐受.　　Treg在维持移植物耐受方面发挥重要作用,Treg种类较多,包括CD4十CD25`Foxp3十调节性T细胞,分泌1L-10的I型T调节细胞(Trl),分泌转化生长因子书(TGF-p)的Tr3细胞,我们研究显示ReIBsiRNADC诱导T细胞分化CD4十CD25十Foxp3十调节J睦T细胞增加.在维持免疫耐受方面存在一个反馈环路,最初的耐受性DC诱导T细胞分化为Treg,而Treg能够合成大量的细胞因子,如IL-10,TGF-(3等来形成一个负向的免疫微环境,这些Th2细胞因子又作用于DC来下调其人类主要组织相容性复合体(}IHC)=,CD80,CD86等表型表达,从而阻止DC进一步成熟_Treg的抑制能力也包括通过剥夺细胞因子产生或细胞溶解作用来诱导效应性T细胞死亡.　　在以往研究中,imDC体外可诱导T细胞低反应性,但输注DC到移植小鼠中,受到各种外源性刺激后DC获得成熟,从而失去其免疫耐受性.利用RelB沉默的DC在移植前输注受者小鼠,可以明显延长受者小鼠心脏存活时间,降低急性排斥反应的发生,病理学检查显示供体来源的耐受性DC提前输注的受者小鼠,其心脏移植物中炎性细胞浸润减少,心肌细胞凋亡减少总之,供体来源的Re1BsiRNADC能在体内外诱导心脏移植免疫耐受.　　参考文献　　Carre(n)o LJ,Riedel CA,Kalergis AM. Induction of tolerogenic dendritic cells by NF-kappaB blockade and Fcgamma receptor modulation[J].Methods in Molecular Biology,2011.339-353.　　陶涛,祝恒成,刘修恒. 小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定[J].中华实验外科杂志,2009,(9):1190-1192.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.09.037.　　周景师,窦科峰,付蓉. GM-CSF调节树突状细胞对移植免疫应答的影响[J].中华实验外科杂志,2004,(2):189-191.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2004.02.024.　　陈建锋,高毅,孙尔维. 供者凋亡细胞预输注诱导同种器官移植免疫抑制的研究[J].中华实验外科杂志,2003,(7):608-610.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2003.07.012.　　Calder VL,Bondeson J,Brcnnan FM. Antigen-specific T-cell downregulation by human dendritic cells following blockade of NF-kappaB[J].Scand J Immuno1,2003.261-270.　　Ouaaz F,Arron J,Zheng Y,et al.Dendritic cell development and survival require distinct. NF-kappaB subunits[J].Immunity,2002.257-270.　　McCurry KR,Colvin BL,Zahorchak AF. Regulatory dendritic cell therapy in organ transplantation[J].Transplant International,2006.525-538.