环介导等温扩增法检测尿液特异基因DD3诊断前列腺癌的价值

　　近10年来我国前列腺癌(PCa)的发病率、病死率呈大幅上升趋势,已成为影响我国男性健康的重要疾病之一。　　血清前列腺特异性抗原(PSA)是临床最常用的前列腺癌诊断标记物,但其只具有前列腺组织特舁性而无前列腺癌组织特异性,增加了前列腺穿刺活检的盲目性,因此,探讨前列腺癌特异性诊断方法具有重要意义。前列腺癌特异基因DD3(拊ferenhddi叩lalrcode3,D")是一种具有极高前列腺癌特异性和较高敏感性的基因[3,逐渐引起了人们嚣视c我们采用环介导等温扩增法由甜LAMP)检测血清PbA异常者尿液DIls基因,探讨其对前列腺癌的诊断价值。　　1材料与方法　　1.1纳人对象选择⒛10年10月-2012年6月我科住院治疗的前列腺穿剌活检F‘血清"A异常者80例,"A4.7~596u酽L,平均183ug/L。术前未行糖皮质激素治疗,无前列腺癌手术史和放疗史。确诊为前列腺增生53例;前列腺癌”例,Gleason评分2~10分,肿瘤分期:B期l例,C期6例,D期15例。收集手术切除组织和术前经前列腺按摩后的尿液30ml。随机选择⒛例血清"A正常者纳入对照组,留取自然排出的尿液30ml。　　1.2方法　　1.2.1尿液游离RNA提取:使用Qiagen公司的RNAeasyMhiKh提取3组尿液样本RNA,具体操作步骤参照说明书。取5淤RNA为模板进行LAMP扩增。　　1.2.2LAMP法检测D":引物设计以GeneBallk公布的人D"mRNA序列信息为准,使用在线设计软件(http://p。merexplorerjp/e/)设汁环介导等温扩增引物。环介导等温扩增引物共有4条,包括2条内引物(FIP、BIP)及2条外引物(「3、B3),由英潍捷綦(上海)贸易有限公司合成。环介导等温扩增内、外序列如下:　FIP:TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC;BIP:CGCCΛTCTTGGGTCATCCATATGTCCTTCCCTCACAA;F3:AGTGACATGTTTTTGCACATT;B3:CATCCTTTAAGGAACACATCAA1.2.3It′-LAMP反应:总反应体积为5淤,各试剂浓度分别为16mmcllFIP、16mn1dBIP、02mmol田、02mmolB3、0351nn1oldNTPs、1rnnlolBetaine、20InmolTrisHCl(pH8.8)、10n1n1()lKCl、10n11nol(NH4)2S04、81nlnolMgs04⒑1%TotonⅩ100、lUΛMⅤ逆转录酶(Rome钾公司)、8UBstDNA聚合酶大片段(NeliE呷-laⅡlBiolabs公司)以及5耐RNA模板:反应条件为c·~R℃忸温反应ωlllln,反应产物于2%的琼脂糖凝胶电泳中进彳j结果观测。　　1.2.4 TAqI酶切反应:鉴于LAMP反应产物的扩增区内包含1个hqI的酶切位点,闪此对扩增产物进行酶切反应,以鉴定扩增产物的特舁性。反应体积为°Oul,包括2。Ll10×buΠor、10ulr,AⅥP反应产物、2。blTaqI酶及6u1超纯水。反应条件为ω℃恒温反应5h,反应产物于2%的琼脂糖凝胶电泳进行结果观测。　　2结果　　2.1扩增反应结果随机选取2例前列腺癌尿液样本中提取出的RNA为样本进行LAMP反应,经I=八MP反应扩增,2例均出现特布的梯状条带,结果显示清晰,证实扩增反应的高效性;X寸LAⅥP产物进行TaqI酶切消化,结果业/Jx梯状条带消失,证实了上述扩增反应的特舁性,见图1。　　2.2D"皋因表达及其与雨清PSA的关系刀例心t列腺癌的D"均呈阳性表达,53例前列腺增生中仅1例DD3∶早阳性表达,⒛例正常对照样本DD3均尢阳性表达c结果显示该方法的敏感性和特异性分别为100%及98,3%。并将该处的LAMP检测缔果与样本的m清PsA水平及组织穿刺结呆进行综合分析c结身廴昆示:m清PSA<4ug/I。自勺20例DD3表达均阝H性,与病理检查结果一致;PSA4~10ug/L的17例中3例DD3阳性,而病理检查仅2例阳性;PSA10~⒛ug/L的“例屮5例DD3网|性,与病理检查结果一致;PSA>⒛u酽L的37例DI)3检测与病理结杲一致。3讨论直肠指检联合"A检查为目前临床公认的甲期诊断前列腺癌的最佳初筛方法。但直肠指检舁常或血清"A升高者中发现前列腺癌仅占⒛%~’~h^%,上述两指标均正常者患前列腺癌的可能性仍可达10%G若以血清"A>30昭/I,作为前列腺穿刺活检阳性标准,阳性率为⒛%~⒛%;以血清"A>25u√I,作为前列腺穿刺活检的临界值,敏感性>%,但特异性仅10%;血清PSA在25~10uμg/l,时阳性预测值(5%;4~10昭/I,时前列腺穿刺阳忤率仅15,9%。另外,前列腺增、前列腺炎、急性尿潴留以及前列腺的各种器械操作和检查均可导致r,thA升高[5],许多患者因此接受了不必耍的前列腺穿刺活检。　　DD3慕因是近年来发现的一种非编码RNA基因,其在前列腺癌区域n勺表达是邻近良性组织的6~15OO倍,在癌细胞含量高于10%的标本屮,D"表达水平为良性对照组的∞倍,即使在癌细胞含董低于10%的标本中,DD3表达水平也达到良性对照组的H倍∴。　　DlB基因在止常前列腺组织中表达较低,而在前列腺癌组织表达极高3⒎,X寸诊断前列腺癌具有极高的特舁性和较高的敏感性,彐^D"表达和前列腺体积无关,但与肿瘤体积以及肿瘤的恶忤程度相关,这些特征均提示DD3为一种莳列腺癌的特异性基因~∷DD3不表达相关蛋白,lNJ此核酸检测技术为检测DD3的一种重要方法JO=目前常用检测方法包括原位扩增法、NoHhcrnlDlot法、差异显示聚合酶链反应(PCR)法等,但试验环境要求高,操作费时。I,AⅥP为等温条件下的核酸扩增技术,其扩增效率较普通PCR技术高出2~3个数帚级,操作简便、时问短、设备要求低。国外学者分别在细菌、病毒、胃癌、乳腺癌等研究屮证实,1'AMP法是-种特异、高效、迅捷的检测方法ll投。我们采用LAMP法对SO例血清"A异常者尿液样本检测发现:A为4~10u的1∷7例中明确诊断前列腺炜2例为10~⒛ug/L的“例中明确诊断前列腺癌5例;PSA)⒛ug/L的歹例中明确诊断前列腺癌⒛例,提示以血清"A值4μg/l,作为前列腺癌穿刺活检的阈值可导致较多患者进行无意义的活检。将LAMP检测结果和活检穿刺结果对比发现,刀例前列腺癌样本DD3均呈阳性表达,53例前列腺增生样本中仅1例DD3阳性,⒛例正常对照样本中均无DD3表达。说明LAMP法检测DD3结果与临床病理检测结果具有较高的一致性,且该检测方法简单、快速,对前列腺癌早期诊断有重要指导价值,但需积累大样本进一步研究。　　[参考文献]　　李鸣,张思维,马建辉. 中国部分市县前列腺癌发病趋势比较研究[J].中华泌尿外科杂志,2009,(06):368-370.doi:10.3760/cma.j.issn.1000-6702.2009.06.003.　　Jemal A,Siegel R,Ward E. Cancer Statistics,2008[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2008,(02):71-96.　　Bussemakers M J,van Bokhoven A,Verhaegh G W. DD3:a new prostate-specific gene,highly overexpressed in prostate cancer[J].Cancer Research,1999,(23):5975-5979.　　Mistry K,Cable G. Meta-analysis of prostate-specific antigen and digital rectal examination as screening tests for prostate carcinoma[J].Journal of the American Board of Family Practice,2003,(02):95-101.　　那彦群. 中国泌尿外科疾病诊断治疗指南[M].北京:人民卫生出版社,2007.33-42.　　Hessels D,Klein Gunnewiek J M,van Oort I. DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer[J].European Urology,2003,(01):8-15.