Livin靶向ASODN对前列腺癌PC3细胞生物学特性的影响

Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的新成员。研究表明iivin mRNA在大多数成人正常组织(胎盘组织除外)中不表达或低表达，而在多种类型的肿瘤细胞系中高表达。Livin表达的组织特异性及功能的多样性， 为肿瘤的基因治疗提供了一条新的途径。沉默或抑制Livin基因的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡的研究已取得一定进展。反义核酸是天然存在或人工合成的核昔酸序列，它可以通过碱基互补原则与目的基因杂交，从而阻止目的基因的表达，抑制细胞增殖，促进凋亡。但遗憾的是，迄今为止，在前列腺癌研究领域尚未见以Livin基因为干预靶点的相关报道。本研究利用反义寡核营酸技术，探讨沉默Livin表达对前列腺癌 PC3细胞生物学行 为的作用，现报告如下。

1材料与方法

1.1主要试剂和材料 人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株P C3购自中国科学院上海细胞研究所。转染试剂Lipo- fectamine2000及总RNA提取试剂TRIzoI购自 Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒购自北京Tiangen公司，四甲基偶氮哗蓝(MTT)和二甲基亚矾(DMSO>购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自Gibcc)公司，Caspase-3活性检测试剂盒购自碧石天生物技术研究所

1. 2细胞培养 PC'3细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基培养，置于37℃饱和湿度、体积分数5%的 CO2细胞培养箱中，定期换液和传代.取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 Livin特异性、hRN A片段的设计及载体构建 Livin反义及错义寡核昔酸序列由上海生工生物工程有限公司合成，并对寡核普酸进行硫代磷酸化修饰。用尤血清无抗生素的DMEM培养液溶解至浓度为20 umol/I·经0. 22um滤膜过滤后· 置于一2 0℃中保存备用。Livin反义寡核百酸 (AS()DN)序列为5'-ACCATCACCGGCTGC- CCAGT-3';错义寡核昔酸(MSODN)序列为5’-GT- CAGCATCTTCCCACGGAG-3'. 1.4细胞转染及分组 细胞进人对数生长期后.按照Iapo- fectamine2000说明书将脂质体分别与反义及错义寡核昔酸在无血清培养基中混合，制成脂质体一寡核甘酸复合物，分别加人培养板中。细胞转染分成四组:①脂质体十ASODN组;②脂质体十MSODN 组;③脂质体对照组;④PPS空自对照组。细胞转染6h后更换含血清培养基，继续培养。

1.5 MTT法检测细胞增殖活力 细胞接种于96孔板，每孔5X 103个细胞，调节寡核昔酸终浓度分别为200, 400, 600, 800 nmol/L，每组设3个复孔。转染后48 h，每孔加人 5 g/L的MTT溶液20ul，在37 C孵育4h后弃上清，每孔加人DMSo> 150ul，振荡裂解10 min待蓝色结晶溶解后，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值，并计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率 (%)一(对照组A值一处理组A值)/(对照组A 值)X l00%。

1.6 RT-PC'R检测Livin mRNA表达水平 用终浓度为600 nmol/I、寡核昔酸转染PC3 细胞，48小时后收获细胞。用TRIzol提取各组细胞总RNA.用琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度。用cD- NA第一链合成试剂盒，37 ℃逆转录1 h合成CD- N A。以Bactor为内参.进行RT-PCR, 循环条件如下:95℃预变性2 min, 95℃变性 30 s,60℃退火30s,72℃延伸30s，共作30个循环; 72 ℃延伸10 minx RT-PCR扩增Livin下游物为5'-TTCTATAAC: TGGCC.'GCTCr-1’下游引物为5'-GGGCT(TC'GTC:TTCC0. 05)。因此，我们选择600 nmol/L 寡核昔酸浓度进行后续实验各处理组细胞所提取的总RNA经检测，完整性和纯度均满足后续实验要求(图扮。RT一PLR结果显示。ASODN组 Livin mRNA的相对含量为(0. 387士0. 05 ).显著低于}soDN组的(1. 086士0. 05 )、脂质体对照组的(1. 044士0. 07)和PBS空白对照组的((1. 149士 0. 06)(图2)，差异有统计学意义(P0.05). 2.4 Caspase-3活性的检测 检测结果表明(图4),PC3细胞转染ASODN 后，其Caspase-3的相对活性为(0. 082士0. 019), 与MSODN组(0. 046士0. 013)、脂质体对照组 (0. 041士0. 015)和PBS空白对照组(0. 043士 0. 017)相比，差异有统计学意义(PGO. 05(图4). 而MSODN组与空脂质体对照组之间比较，差异无统计学意义(P<0.05）.

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 用终浓度为600 nmol/I寡核营酸转染烈界细胞，转染8小时后收集各组细胞.用预冷的洗细胞2次，用工火结合缓冲液重新悬浮家电孙洲节浓度为1X10一1X10 ml:取100ul匆斗液于流式管中. Annexin找一执州PI后轻轻混匀·避光染色15 min:再加缓冲液.1小时内用流式细胞仪检测细撰八耳一以百分数表示 .

1.8 Wtpase-3活性的测定 测定步骤按照碧云天公司的试剂盒成书迸行收集各组细胞.冰!裂解1min后上清。加人反应缓冲液80ul待测样品,退当混匀.随后加人Ac-DEVIpVA2 mmol C水浴1> h.用酶标仪测定10min:波长处值.

1. 9裸鼠体内成瘤实验 收集处于对数生长期的PC3细胞， 右侧皮下接种2X10个细胞待皮下肿喃直径超过0. } cm后.将裸鼠随机分为两组，每组① ASODN组:采用瘤内多点注射法，隔天注刹一几次注射八SODN的浓度为600 nmol.每只。注射之前先把脂质体与寡核首酸混合，室温静攫 20 minx②MSODN组:注射MSODN.齐睡量::万法同ASC)DN组。每3天用游标卡尺测量肿瘤凡小。计算肿瘤体积:V=0.5XLXWZCV为种愉体积.工、为肿瘤长径.W为肿瘤短径)，绘制种瘤体内生长曲线。

10统计学处理 应用SPSS 13. 0统计软件.用均数一味准差表示。两组之间数据比较采用配对资料、检验。多组之间比较采用以P<0.. 05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1 Livin ASODN对PC3细胞增殖的抑制作耀 不同浓度的I_ip-ASODN处理PC3细跑欲少多时后.细胞生长受到抑制.200, 400, 600,800 nmol/I组抑制率分别为22. 29% , 35.04% 68%和62. 39%，且随浓度增加而递增(表1)，与对照组相比，差异有统计学意义(P < 0. 01). MSODN组、空脂质体对照组之间相比较，差异无统计学意义(P>0. 05) 2. 2转染后PC3细胞Livin mRN A表达的变化 Livin反义寡核昔酸浓度为600 nmol-'L时，细胞抑制率达60. 68 %，继续增加浓度.抑制率增加不显著(P>0. 05)。因此，我们选择600 nmol/L 寡核昔酸浓度进行后续实验各处理组细胞所提取的总RNA经检测，完整性和纯度均满足后续实验要求(图扮。RT一PLR结果显示。ASODN组 Livin mRNA的相对含量为(0. 387士0. 05 ).显著低于}soDN组的(1. 086士0. 05 )、脂质体对照组的(1. 044士0. 07)和PBS空白对照组的((1. 149士 0. 06)(图2)，差异有统计学意义(P0.05). 2.4 Caspase-3活性的检测 检测结果表明(图4),PC3细胞转染ASODN 后，其Caspase-3的相对活性为(0. 082士0. 019), 与MSODN组(0. 046士0. 013)、脂质体对照组 (0. 041士0. 015)和PBS空白对照组(0. 043士 0. 017)相比，差异有统计学意义(PGO. 05(图4). 而MSODN组与空脂质体对照组之间比较，差异无统计学意义(P<0.01).

2. 2转染后PC3细胞Livin mRN A表达的变化 Livin反义寡核昔酸浓度为600 nmol-'L时，细胞抑制率达60. 68 %，继续增加浓度.抑制率增加不显著(P>0. 05)。因此，我们选择600 nmol/L 寡核昔酸浓度进行后续实验各处理组细胞所提取的总RNA经检测，完整性和纯度均满足后续实验要求(图扮。RT一PLR结果显示。ASODN组 Livin mRNA的相对含量为(0. 387士0. 05 ).显著低于}soDN组的(1. 086士0. 05 )、脂质体对照组的(1. 044士0. 07)和PBS空白对照组的((1. 149士 0. 06)(图2)，差异有统计学意义(P0.05). 2.4 Caspase-3活性的检测 检测结果表明(图4),PC3细胞转染ASODN 后，其Caspase-3的相对活性为(0. 082士0. 019), 与MSODN组(0. 046士0. 013)、脂质体对照组 (0. 041士0. 015)和PBS空白对照组(0. 043士 0. 017)相比，差异有统计学意义(PGO. 05(图4). 而MSODN组与空脂质体对照组之间比较，差异无统计学意义(P<0.01).

2. 3 livin基因表达沉默后对PC3细胞凋亡的影响 转染后48 h, ASODN组、MSODN组、脂质体对照组和PBS空白对照组的P C'3细胞凋亡率分别为(30. 5士2.4)%,<2.6士0. 5)%、2.7士0.4W%和 ( 3. 1士0. 4 ) %(图3 ) o. ASODN组和其他各组相比，凋亡率显著增加(PLO. O1)，而后三组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05). 2.4 Caspase-3活性的检测 检测结果表明(图4),PC3细胞转染ASODN 后，其Caspase-3的相对活性为(0. 082士0. 019), 与MSODN组(0. 046士0. 013)、脂质体对照组 (0. 041士0. 015)和PBS空白对照组(0. 043士 0. 017)相比，差异有统计学意义(PGO. 05(图4). 而MSODN组与空脂质体对照组之间比较，差异无统计学意义(P<0.01)

2.4 Caspase-3活性的检测 检测结果表明(图4),PC3细胞转染ASODN 后，其Caspase-3的相对活性为(0. 082士0. 019), 与MSODN组(0. 046士0. 013)、脂质体对照组 (0. 041士0. 015)和PBS空白对照组(0. 043士 0. 017)相比，差异有统计学意义(PGO. 05(图4). 而MSODN组与空脂质体对照组之间比较，差异无统计学意义(P<0.01).

2. 5 Livin基因表达沉默后X'细胞成瘤性的影响 裸鼠在接种肿瘤后，7天左右接种部位肉眼可见瘤块隆起。MSODN组瘤体增长迅速，而 ASODN组肿瘤生长相对较慢。从第15天起， ASODN组与MSODN组瘤体大小差异有统计学意义(p<0.05).随后差异更加显著(图5).

3讨论

前列腺癌的传统治疗方式包括手术治疗、内分泌治疗、化疗和放射治疗，虽然有一定的效果，但对进展期和已发生远处转移的前列腺癌疗效尚不理想。尤其是雄激素非依赖性前列腺癌，传统的去势术和雄激素阻断治疗对其不起作用，因此治疗更为棘手。近年来，基因治疗的兴起为癌症的治疗，提供了新思路、新方法。基因治疗目前虽仍在探索阶 段，但其诱人的前景备受瞩目。 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学行为，一旦细胞凋亡受到抑制，细胞便得以存活和增殖，最终可能导致肿瘤的发生。人类凋亡抑制蛋白(inhib- itor of apoptosis proteins,IAPs)是一类重要的抗细胞凋亡因子，在细胞的凋亡和肿瘤的发生过程中发挥着重要的作用。2000年，科学家根据IAP:同源序列用含有杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列。

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