多中心尿路上皮肿瘤克隆起源的FISH研究

尿路上皮肿瘤是最常见的泌尿系肿瘤，90%以上为尿路上皮(移行)细胞癌。尿路上皮癌具有较高的多中心发生率和复发率，形成多中心尿路上皮肿瘤。目前对尿路上皮癌多中心发生的克隆机制及克隆起源还不清楚。本研究通过荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)技术对多中心尿路上皮肿瘤3,7，17号染色体及9号染色体pl6(9p16)位点的变异进行检测，以探讨多中心尿路上皮肿瘤的克隆起源。现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料

本组多中心尿路上皮肿瘤患者28例，共70枚肿瘤，均来自大连医科大学附属第一医院泌尿外科手术患者。男18例，女10例。其中同时性尿路上 皮肿瘤21例，肿瘤46枚;异时性9例，为病理科存档的蜡块，肿瘤24枚，其中2例既有同时性又有异时性肿瘤。所有同时性多中心尿路上皮癌均为同一时间发现的单器官多发肿瘤或多器官肿瘤，异时性肿瘤发现时间为3个月一10年。同时留取远离肿瘤组织的正常尿路上皮组织28例。所有肿瘤标本均经病理检查确诊为尿路上皮癌。分期根据 2002年AJCC癌症分期标准，T。期肿瘤10枚，T, 期3}枚，T:期22枚，T:期3枚。分级依据2004 年WHO标准，G1 23枚，G2 32枚，G3 15枚。

1.2研究方法及步骤

研究方法及步骤如下:①将组织蜡块制成1 }m组织石蜡切片。②标本经脱蜡、复水和消化进行预处理。③分别将3/7染色体着丝粒探针 CCSP3/CSP7>及9p16位点/17号染色体着丝粒探针(GLP p16/CSP17)与杂交缓冲液混合物加于玻片杂交区域在杂交仪中变性杂交。④杂交后洗涤 玻片，暗处自然干燥，滴加DAPI复染剂后暗处放置10 mina⑤荧光显微镜下观察结果:满意的标本应是75%以上细胞核中均有杂交信号，且各通道信号均清晰可辨、杂交均匀，细胞核轮廓不清、重叠、破损及淋巴细胞不计数。遵循随机计数的原则，由两名专业人员同期计数，结果偏差较大则重新计数。在CSP3/CSP7组中，CSP3荧光信号为绿色，CSP7为橘红色;在GLP p16/ CSP17组中， GLP p16荧光信号为橘红色，CSP17为绿色。正常细胞的CSP3,CSP7,CSP17及GI_P p16均为二倍体，即细胞核分别可见2红2绿信号。出现多于或少于2个信号的非整倍性改变(染色体丢失或数目增加)、缺失或扩增即为异常。用20例正常尿路上皮组织的FISH结果建立阂值，每个探针组合计数100个细胞，计算出现上述异常的细胞数所占百分比，由其均数加3个标准差计算出正常I}值.其特异性达99.90%。

1.3结果判断

计数100个肿瘤细胞。在CSP3, CSP7, CSP17，少于2个信号点的细胞比例大于阂值为染色体丢失，多于2个信号点的比例大于阂值为染色体数目增加，介于两阑值之间为正常。在GLP p16，无信号点或只有一个信号点的细胞比例大于阂值为p16缺失，多于2个信号点的比例大于阂值为p16扩增，介于两阂值之间为正常。分别比较各多中心灶瘤灶间CSP3 , CSP7 , CSP17及GLP p16 异常的类型是否一致，一致则认为多中心灶为同一克隆起源，否则为独立克隆起源。

2结果

2. 1正常尿路上皮的FISH检测结果及建立阂值 正常组织的FISH图像见图to阑值一平均值 (M)}3X标准差(SD>O CSP3,CSP7,CSP17染色体数目增加的闽值分别为9.6%,10.8%,11.2%, 染色体丢失的闽值分别为7.2%,7.8%,6.4%; GLP p16定位于9p21区带，其扩增的阑值为5. 400，缺1个信号点的阂值为13. 2%，缺2个信号点的闽值为6.8%. 2. 2多中心尿路上皮肿瘤的FISH检测结果 肿瘤组织的FISH图像见图20 70枚肿瘤中， 3,7,17号染色体数目增加的分别有38枚、48枚、 42枚，染色体丢失分别有24枚、17枚、18枚，染色体无明显异常的分别有8枚、5枚、10枚。p16位点缺失52枚，扩增12枚，无明显改变的有6枚。 28例患者中，18例(同时性17例，异时性1 例)多中心灶各瘤灶间CSP3,CSP7,CSP17及 GI_P p16变异类型完全一致;10例(同时性2例，异时性6例，既有同时性又有异时性肿瘤2例)不完全一致(表1)，其中8例GLP p 16变异相同(缺 失6例，非缺失2例),CSP3,CSP7,CSP17变异不完全相同。异时性病例中，后发肿瘤比先发肿瘤染色体改变多。2例GLP p16变异不同的均为异时性肿瘤,CSP3/CSP7,CSP17变异亦不完全相同，初发肿瘤比随后发生的肿瘤染色体改变多。

3讨论

多中心尿路上皮肿瘤包括泌尿系统单个器官的多发肿瘤，及多个器官同时和(或)异时发生的肿瘤和外科手术后不同部位的复发。多中心尿路上皮肿瘤具有高复发率，高进展率和高死亡率的特点川目前对其克隆机制及克隆起源尚未阐明，主要有两种学说:场效应学说((field cancerization) 认为整个尿路上皮在共同的致癌物质作用下，多中心肿瘤形成于转化细胞的独立克隆，即多克隆起源。单克隆学说认为多中心肿瘤形成于单个癌变细胞的腔内种植(intraluminal seeding)w或上皮内迁移(intraepithelial migration)。由此产生的多中心灶起源于同一克隆，即单克隆起源。 多中心尿路上皮癌顺尿流发生率明显高于逆尿流发生率，一直以来单克隆学说占主导地位然而.对于同时或异时出现的双侧上尿路肿瘤、逆尿流发生的肿瘤以及顺尿流发生但间隔时间较长的肿瘤，难以用单克隆学说解释Jones等一通过对多发尿路上皮癌患者58枚肿瘤3个微卫星位点的杂合性缺失分析(LUH)及X染色体失活分析(女性i1例)。发现大多数肿瘤间LC H及X染色体失活类型均不一致，提示这此肿瘤为多克隆起源。研究多中心尿路上皮肿瘤的发生机制及克隆起源对于了解其生物学特性、判断预后.以及指导临床治疗及术后监测均有重要意义。 最常见的单克隆关系的解释是肿瘤有相同的祖细胞。祖细胞分化生成很多子细胞，子细胞通过不同的突变积累引起新的肿瘤生成.可表现为复发或多发肿瘤要证明肿瘤有相同的起源，就要证明它们有相同的祖细胞，亦或有相似的肿瘤事件。

最近研究发现，尿路上皮癌的发生发展与3, 7,9,17号染色体的频发异常(数目异常和结构畸变)密切相关，其中9号染色体的改变为早期染色体改变.而定位于9 P21区带的p16位点缺失为尿路上皮癌发生过程中一系列遗传事件中最早的染色体改变，3,7,17析号染色体的非整倍性改变为肿瘤进展过程中染色体变异的重要环节。FISH 技术可检测这些染色体的改变。相同的染色体改变提示肿瘤来自同一克隆。日前已有成功将 FISH技术用于膀耽透明细胞腺癌、肾多中心性乳头状肾癌等多项肿瘤克隆起源研究的报道。 以往对多中心尿路仁皮肿瘤克隆起源的研究主要集中在高级别浸润性肿瘤，运用的分子生物学 技术如P53基因突变、LOH,X染色体失活等也主要是针对染色体结构变异的分析。少数通过 FISH技术进行克隆起源研究的报道也多是集中在对单一染色体结构变异的研究在我们的研究中，相当一部分肿瘤为低级另al非浸润性肿瘤.}通过FISH技术同时对9p16位点的结构畸变(扩增或缺失)及3,7,17号染色体的数目异常(增加或丢失)进行了分析，使对多中心灶染色体变异类型的比较更全面。 本组研究中，3,7,17染色体数目增加发生率分别为54.3%,68.6%,60%,9p16缺失率为 74. 3 %，与文献报道基本一致。

本组所有肿瘤的染色体变异类型分四种情况。 其一，多中心灶间3,7,9,17号染色体变异类型完全相同，为同一克隆起源。 其二，多中心灶间染色体变异不完全一致. 9p16均为缺失改变(病例1-6)众所周知·肿瘤发展早期出现的基因变化对判断多中心灶是否来自同一个祖细胞至关重要。定位于9p21区带的 p16位点缺失作为尿路卜皮癌发生过程中最早的染色体改变如果相同.该多中心灶就为共同的克隆起源，而随后出现的3,7,17号染色体改变为肿瘤发展的晚期事件.可出现不一致的染色体变异本类型病例多中心灶的9p16位点均为缺失改变，这些多中心灶来自相同的克隆起源。 其三，多中心灶间染色体变异不完全一致， 9p16为相同的非缺失改变(病例7 , 8 ) . Bollmann 等研究发现肿瘤细胞染色体异常的严重程度与膀眺癌的进展密切相关。也就是说.在单克隆起源肿瘤中.后发肿瘤作为原发肿瘤进展的一种表现形态，其应该比原发肿瘤有更多、更复杂的染色体改变，否则为多克隆起源可能本类型病例虽然P16 位点非缺失性改变不能提供最早期的遗传信息，但作为相对早期的9号染色体改变如果相同，且随后出现的3,7,17号染色体改变在肿瘤2(后发肿瘤) 多于肿瘤1(原发肿瘤).均为从正常到染色体数目增加的进展过程，符合上述肿瘤进展规律，为单克隆起源。 其四，多中心灶的9号染色体改变不同。病例 9为反复发生4次的膀肤尿路上皮癌，最后1次为多发病灶(肿瘤4,5)。初发肿瘤(肿瘤1)9p16位点为扩增.而随后发生的肿瘤(肿瘤2,3,4,5)9p16 位点均为缺失。且3号染色体在肿瘤1为数自增多，肿瘤2为正常。根据第二、三种类烈的判断方法，肿瘤2,3,4,5来自同一克隆起源，肿瘤1为独立克隆起源。、同理，病例10肿瘤1,2的9p16位点改变不同，且3,17号染色体改变不符合肿瘤进展规律屯为独立克隆起源。

综上所述，本研究中，26例(92.9%)可能为相同克隆起源，即单克隆起源，另外2例来自不同的细胞克隆，即多克隆起源可能。进一步比较发现，2 例被认为来自不同克隆起源的肿瘤均为异时性肿瘤，10例同时性肿瘤均被证明来自同一克隆起源。且在异时性肿瘤中的间隔时间较短的肿瘤(3-30 个月)为单克隆，间隔时间较长的2枚肿瘤(分别约为5年和11年)为多克隆起源，提示多中心尿路上皮肿瘤间隔时间越久，独立克隆起源的可能性越大。

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