NNMT在肾透明细胞癌的表达及对肾癌细胞侵袭能力的影响

，肾细胞癌(renal cell carcinoma RCL)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占全身恶性肿瘤的3%[1]肾癌侵袭和转移能力强.且对化疗、放疗及传统免疫治疗均不敏感，患者预后较差。我们前期应用蛋白质谱分析技术发现尼克 酞胺一N一甲基化酶(nicotinamideN methvtrans- fera ae.NNMT)在肾癌细胞株78 6-O中的表达水平比正常IIXr1小管土皮细胞HKC升高近斗，倍。因此本实验主要研究NNMT在肾透明细胞癌组织中的表达情况，并进一步探讨它对肾癌细胞侵袭能力的影响

1资料与方法

1.1临床资料 3例肾癌患者的肿瘤组织及其对应癌旁正常组织取自解放军总医院泌尿外科2009-2011年手术标本.并经术后病理确诊为肾透明细胞癌，且所有患者术前均未接受放、化疗。组织标本切除后存放人一80℃冰箱中保存。正常肾小管卜皮细胞株 HK肾癌细胞株7 86-()均为本实验室保存.胎牛血清、DM E M / F 12和RPMI1640培养基购自美国 Gibcc。公司总RBA提取试剂盒购自北京艾德莱牛物科技有限公司;逆转录试剂盒及荧光定量 YC'R试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;NNMT引物由卜海Invitrogen公司合成; NNMT-siRNA由上海吉码公司合成:TRanswell 小室购自corning公司;鼠抗人NNMT单克隆抗体购自Abcam公司，转染试剂Lipofectamine2000 购自Inuit rogen公司。

1.2检测方法

荧光定量PCR检测NNMT的表达:按照 RV提取试剂盒说明书抽提细胞和组织的总 RNA，并逆转录合成。DNA应用Primer 5. C设计引物.NNMT上游引物:5 '-TTUGTTC:TAG一 GCACTCTG-3，下游引物:5’- TGTCA ATCAG- CAGGTCTC-3'，扩增产物105PB;内参基因 SDH八上游引物:5’ -TCCATCGCA T AAGAG- CAA- 3 '.下游引物:p '- TT('CGTGAT(T}(iA- CAACAC-3’扩增产物197 bp。按照SY br-(green 试剂盒说明进行PC:R扩增，使用的仪器是 ABI公司的7500荧光定量仪，反应程序为:95 C 30 s:95 ℃ 5s:60℃ 34 s，作10个循环以人SDHA做为内参照。 Western blot检测NV MT的表达:采用RIPA 蛋白裂解液分别提取细胞和组织的总蛋白，BCA 蛋白定量法测定样品蛋白浓度。蛋白变性后经 SDS-PAGE(10%分离胶,5%浓缩胶)电泳分离后. 转印致PVDF膜(200 mA, 2 h) , 5%脱脂奶粉室温封闭lh，后加人NVMT鼠抗人NVMT一抗(1: 1 000稀释). 4一C孵育过夜后，TF}ST洗膜3次.加入二抗(1:3 000 )室温孵育1 h , TBST洗膜3次. 最后用ELC化学发光检测.暗室中显影定影后胶片保存，用图像分析仪测定各样品显色的灰度值. 利用灰度值进行蛋白相对表达分析。以B-actin为内参.1:1 000稀释使用. 细胞培养及转染:细胞培养于含10%胎牛血清、1G0 Uml青霉素、100 ug/ml链霉素的RP1V1I 1640培养基中。置于37 ℃培养箱中培养NNMT的特异、iRNA序列为:正义链:CxCLCT(T(.'LJAC'AC:入八UCH }AAU丁丁.反义链:AUU(JGAUUCTUGLJAGCCAGCTT;阴性对照序列:正义链:LTUCUCCGAACGUGU- C ACGL}T'I}，反义链:AC GUCT:}C::}('CTL! UC'(-T- GACTAA TT。实验分为1}'I}LVIT-S1R}lA组(加人 1}1}' i'VI"r-aiRNA及转染试剂)、阴性对照组(加人阴性对照序列及转染试剂)、空白对照组(未作任何处理)取对数生长期细胞.每孔按照3X10"细胞密度接种与6孔板培养皿中，待细胞生长达到70 一80覆盖率时.按照Lipofectamine 200。转染试剂操作步骤进行、iRiUA转染.转染61:后更换培养基继续培养。 Transcell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的变化:将孔径为8 mm的Transw山小室放人 24孔板中·每个I'ranawell小室加人60浏含}0 mg一工一Matrigel(基质胶)稀释液.3a C培养箱放置 21:使其成胶。各组细胞转染铭小时后胰酶消化，用含1%胎牛血清的RPMI 164。培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度至IXlOs个细胞/ml，加200细胞悬液在Transw ell小室中，下室加人500 Eel 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。各组细胞在37摄氏度,培养箱中培养24小时后取出小室，用1%多聚甲醛固定下室细胞.o. 1%结晶紫染色.在100倍显微镜下观察并拍照.随机计数生个视野中的细胞数目，并计算平均值。实验重复3 次。

1. 3统计学处理 采用SPSS 1 3.0统计一软件分析.数据以X士S、表示，两组数据比较采用t检验.多组之间的比较采用单因素方差分析。P <0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1 NNMT在正常肾小管上皮细胞HK(}和肾癌细胞78 6-O中的表达情况 收取正常肾小管上皮细胞HKC:和肾癌细胞 786-O，提取细胞总RNA后逆转录合成。DNA.进行RT-PCR检测;并相应收取细胞总蛋白，进行 Western blot检测。RT-PLR结果显示正常肾小管上皮细胞HKC mRNA表达水平为(0. 3683士 0. 01229) '肾癌细胞786-O mR\A表达水平为 (2. 461士0. 1651).肾癌细胞7 8 6-O中NNMT的 mRNA水平显著高于HKC细胞(P <0.01). Western blot结果显示，786-()细胞NNMT蛋白表达水平显著高于人正常肾小管上皮细胞HKC (P <0. 01)(图1)。

2. 2 NNMT在肾透明细胞癌组织及对应癌旁正常组织中的表达水平 随机选取30例透明细胞癌组织及对应的癌旁组织，提取组织总kNa并逆转录合成cDNA.进行 RT--PCR检测，同时提取组织总蛋白，进行Wcsr ern blot检测。肾透明细胞癌组织中NNMT的 rnkNA的表达水平为(1. 582士0. 2115 ) ,明显高于癌旁组织的(0. 1269士0. 04279>, P<0.01)

2. 3细胞转染、SIRNA后NNMT MRNA和蛋白的表达水平 786-0细胞分别转染NNMT MRNA阴性对照(阴性对照序列)、空白对照(未做任何处理)48 小时后，分别收取细胞总RN1后逆转录合成cD- N.A，并提取相应的细胞总蛋白NNMT-siRNA 组、阴性对照组与空白对照组NNMT MRNA表达水平分别为(0. 5094士0. 0263劝、(2. ll}二 0. 1588),(2. 614士0. 04327) , NNMT-siRNA组与阴性对照组及空白对照组相比，NNM'T的表达显著降低.P <0. 001) Western blot结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，N NMT的蛋白表达水平在N NMT-siRNA组显著降低(P <0.01). 见图3

2.4 NNMT下调抑制肾癌细胞侵袭能力 Western blot结果显小肿瘤组织中NNMT的蛋白表达水平较癌旁组织的水平明显增高气(P<0.01)(图2)。在30例肾透明细胞癌组织中。 NNMT的mRNA表达水平与患者年龄、性别及组织病理分级无统计学意义(P<0.05).但在肿瘤大小与不同临床分期间的衷达差异有统计学意义 (P<0.05).见表1 取对数生长期肾癌细胞786-0铺在6孔板里，分别转染NNMT-siRNA序列和阴性对照序列.以未做任何处理的细胞做空白对照，转染48小时后收集细胞.进行Transwell实验检测细胞浸袭能力的变化结果显示:与阴性对照组及空白对照组相比, NNMT-siRNA组细胞的侵袭能力下降(p< 0.05)，见图1,说明抑制}'1}}WT的表达后%86-() 细胞的侵袭能力显著降低。

3讨论

人类NNMT-siRNA基因位于 11号染色体的短臂 (11q23)，它由三个外显子和两个内含子组成.其编码的mRNA分子长度为952个核营酸，其编码的蛋自质长度为264个氨基酸鱿。NNMT.主要生理作用是催化尼克酞胺和其他毗咙物甲基化，形成毗陡环，参与许多药物和一些异生物质的生物转化。 近期研究表明，NNMT蛋白含量和mRNA水平在甲状腺乳头状癌、胰腺癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、肝癌等多种恶性肿瘤中表达增高，并在结肠癌癌患者的血清中以分泌型存在，可能成为结肠癌的一种血清标记物Bromberg等扮又提出把 NNMT作为精神分裂症的病因学的概念。 N N MT是维持尼克酚胺平衡的关键酶，因此可以推测NNMT的增高可影响尼克酚胺参与的细胞功能，肿瘤干细胞高表达NNMT通过催化尼克酸胺的降解.进而增强肿瘤于细胞的放疗抵抗从。 Pozzi等采用RNAi技术敲除NNMT的表达后能够显著抑制KB肿瘤细胞的增殖，并降低软琼脂克隆形成能力。Sartini等分析口腔鳞状细胞癌患者组织和唾液中NNMT的表达，推测NNM"h 可以作为早期或非侵袭性口腔癌检测的潜在标记物Riester等采用基因芯片技术分析93例膀耽癌组织标本，发现NNMT在肿瘤组织中高表达，并把其作为临床预测高危性膀胧癌生存率的基因之一。又有学者发现与肿瘤关系较为密切的信号传导与转录激活因子stat3能够上调N NMT的表达，这些都说明NNMt在肿瘤的发生和发展中可能扮演重要的角色。

我们前期应用蛋白质谱技术发现.与正常肾小管上皮细胞HKC相比，NNMT在肾癌细胞株 7 8 6-O中异常高表达，本实验结果进一步显示 NNMT在肾透明细胞癌组织中表达增高将 NNIVIT的mRNA表达情况与肾透明细胞癌患者的临床病理特征相结合，分析结果显示NNMT在肿瘤大小葱7 cm的肾癌组织中表达显著升高(P <0.001)，其表达与肿瘤大小成负相关;在I,II期 肾癌组织中的表达水平较班、W期肾癌组织中的表达水平显著升高(P <0. 05)，但与患者的性别和年龄无关。我们进一步用siRNA技术下调 NNMT的表达后，发现穿过Transwell小室聚碳酸醋膜的细胞数明显减少，说明下调肾癌细胞中 NNMT的表达将抑制肾癌细胞的侵袭能力。 综上所述，本实验结果表明NNMT mRNA的表达与肾透明细胞癌的肿瘤大小及临床分期关系密切，随着临床分期及肿瘤直径的升高，NNMT mRNA的相对表达含量呈降低趋势，这一结果提示NNMT可能在肾癌的发生发展中发挥重要作用，其表达状态可能作为肾癌早期诊断的预测指标。同时NNMT在肾透明细胞癌中发挥生物学功能的具体分子机制有待进一步深人研究，进而为肾癌分子靶向治疗提供新的思路。

参考文献

[1] Markus Roebler,Wolfgang Rollinger,2 Stefan Palme et al.Identification of Nicotinamide N-Methyltransferase as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Cancer. . 2005

[2] Rogers CD,Fukushima N,Sato N, et al.Differentiating Pancreatic Lesions by Microarray and QPCR Analysis of Pancreatic Juice RNAs. Cancer Biology and Therapy . 2006

[3] Emanuelli M,Santarelli A,Sartini D,Ciavarella D,Rossi V,Pozzi V,Rubini C,Lo ML.Nicotinamide N-Methyltransferase upregulation correlates with tumour differentiation in oral squamous cell carcinoma. Histology and Histopathology . 2010

[4] D’’Andrea FP,Safwat A,Kassem M,Gautier L,Overgaard J,Horsman MR.Cancer stem cell overexpression of nicotinamide N-methyltransferase enhances cellular radiation resistance. Radiotherapy and Oncology . 2011

[5] Gottardo F,Liu CG,Ferracin M, et al.Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urologic Oncology . 2007

[6] Wu Y,Siadaty MS,Berens ME,et al.Overlapping gene expression profiles of cell migration and tumor invasion in human bladder cancer identify metallothionein1E and nicotinamide N-methyltransferase as novel regulators of cell migration. Oncegene . 2008

[7] Pozzi V,Mazzotta M,Lo ML,Sartini D,Santarelli A,Renzi E,Rocchetti R,Tomasetti M,Ciavarella D,Emanuelli M.Inhibiting proliferation in KB cancer cells by RNA interference-mediated knockdown of nicotinamide N-methyltransferase expression. Int J Immunopathol Pharmacol . 2011

[8] Sartini D,Pozzi V,Renzi E,et al.Analysis of tissueand salivary nicotinamide N-methyltransferase in oralsquamous cell carcinoma:basis for the development ofa noninvasive diagnostic test for early-stage disease. Biological Chemistry . 2012

[9] Riester M,Taylor J M,Feifer A,et al.Combinationof a novel gene expression signature with a clinical no-mogram improves the prediction of survival in high-riskbladder cancer. Clinical Cancer Research . 2012

[10] Aksoy S,Brandriff B F,Ward A,et al.Human nico-tinamide N-methyltransferase gene:molecular cloning,structural characterization and chromosomal localization. Genomics . 1995