单侧睾丸扭转对未扭转侧睾丸的影响及L-NMMA的保护作用
发表时间：2012-04-19 浏览次数：607次
作者：林孝坤1，秦乐2，徐鲁白1，蔡景理1，刘斌1，陈通克3，陈肖鸣2 作者单位：(1.温州医学院附属第二医院 微创外科，浙江 温州 325027;2.温州医学院附属育英儿童医院外科，浙江 温州 325027;3.温州医学院 实验动物中心，浙江 温州 325035)
【摘要】 目的 ：探讨大鼠单侧睾丸扭转对未扭转侧睾丸生精功能的影响及N-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)对未扭转侧睾丸早期损伤的保护作用。方法：21只健康雄性青春期前SD大鼠随机均分为假手术对照组(A组，n =7)、睾丸扭转复位组(B组，n =7)和睾丸扭转复位+静脉注射L-NMMA组(C组，n =7)。按Turner法建立睾丸扭转模型，喂养至术后7 d时处死，即刻采集各组大鼠未扭转侧睾丸标本，测定睾丸组织丙二醛(MDA)水平、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和白细胞介素-6(IL-6)含量，同时进行组织病理学观察。结果：与B组相比，C组MDA值、NO、NOS、IL-6含量明显下降，病理学上表现为平均曲细精管直径明显升高， 而睾丸结构评分则明显偏低，两组间比较差异均有显著性(P<0.05)。结论：L-NMMA通过抑制NO及NOS的产生，减轻大鼠单侧睾丸扭转复位后对侧睾丸的早期损害。
【关键词】 N-甲基-L-精氨酸;睾丸扭转;一氧化氮;睾丸损伤;大鼠
Abstract: Objective: To investigate the influence of unilateral testicular torsion on the contralateral testicular spermatogenetic function and the protective effects of L-NMMA in early stage of contralateral testis injury. Methods: Twenty-one prepubertal Sprague-Dawley rats were equally randomly divided into Group A (sham-operation control)，B(torsion/detorsion)and C (torsion/detorsion plus injection of L-NMMA)，7 rats in each group. The testiculartorsion/detorsion model was established with the Turner method. All the rats were fed under thesame condition for 7 days and sacrificed，and all the right(untwisted)testis were removed fromrats. Then the biochemical parameters，such as malondialdehyde(MDA)，nitric oxide(NO)，nitricoxide synthase(NOS)activ-ity and interleukin 6(IL-6)were evaluated;histology and seminiferoustu-bule diameters were assessed. Results: Compared with Group B (torsion/detorsion)，thebiochemical parameters，includ-ing the level of MDA，NO，NOS and IL-6 in Group C(torsion/detorsionplus injection of L-NMMA) decreased significantly while the mean seminiferous tubular diameterof contralateral testis and histological grades maintained in a better condition. Conclusion: Byinhibition of tissue NO/NOS production，L-NMMA can reduce the damages on contralateral testisof prepubertal rats with unilateral testicular torsion during the early period.
Key words: L-NMMA;testicular torsion;NO;testis injury;rats
睾丸扭转又称精索扭转，指因睾丸引带异常致睾丸在阴囊内以精索为轴出现异常旋转， 多见于25岁以下青少年，发病率约为1/4 000[1]。长时间的单侧睾丸扭转，不仅可以引起同 侧睾丸生精功能损害，亦可对对侧睾丸产生影响，最终可以引起患者生育能力下降。因此早 期的干预措施显得至关重要。药物治疗将成为今后睾丸扭转复位后睾丸保护研究的重要方向 之一。本研究通过建立大鼠单侧睾丸扭转模型，研究单侧睾丸扭转对未扭转侧睾丸生精功能 的影响及N-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)在大鼠单侧睾丸扭转复位后对侧睾丸早期损伤中的保护作用，以期为临床治疗提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
取质量为90～110 g健康雄性(日龄约30 d)的青春期前SD大鼠21只，购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK(沪)2003-0003，在温州医学院实验动物中心SPF条件下饲养。
1.2 动物分组及模型建立
将21只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，假手术对照组(A组，n=7)、睾丸扭转复位组(B组，n=7)和睾丸扭转复位+静脉注射L-NMMA组(C组，n=7)。睾丸扭转模型按照Turner法[2]制备。2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左下腹小切口，游离左侧睾丸，切断睾丸引带，分离周围组织至附睾头。A组7只大鼠，仅将单侧睾丸游离后再缝于阴囊壁固定。B、C两组则将左侧睾丸沿精索方向顺时针扭转720 °，固定扭转侧睾丸防止自然复位，维持4 h后原切口打开复位扭转睾丸，关闭切口。其中C组大鼠在睾丸扭转复位前30 min予尾静脉缓慢注射L-NMMA 30 mg/kg。
1.3 标本制备
各组大鼠均在同等条件下喂养至术后7 d，用快速脱颈法处死，采集未扭转侧睾丸标本，将所有大鼠睾丸标本沿中轴切开分为两部分，一部分睾丸配置成组织匀浆行相关生化测试，另一部分睾丸迅速置于10%的中性福尔马林中待制作石蜡包块。
1.4 检测方法
1.4.1 生化检测指标：按试剂盒要求制备组织匀浆，采用化学比色法测定丙二醛(MDA)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性，硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量，ELISA法测定白细胞介素-6(IL-6)，操作步骤严格按试剂盒说明书要求进行。
1.4.2 睾丸组织病理学检查：
石蜡切片常规HE染色，置于光镜下镜检，观察睾丸曲细精管结构、计数生精上皮层数、测量平均曲细精管直径(MSTD)、睾丸组织结构评分[3]。等级1：正常睾丸，结构层次分明，生殖细胞排列整齐有序。等级2：受损睾丸，生殖细胞排列较等级1不规则，结构松散(彼此细胞间无黏附)，但紧贴精细小管排列。等级3：较重受损睾丸，生殖细胞排列更加不规则，且有脱落、缺失，可见核固缩现象，精细小管边界模糊不清。等级4：严重受损睾丸，紧贴精细小管的生殖细胞出现明显的凝固性坏死。
1.5 统计学处理方法
多组比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐性用LSD检验，方差不齐性用Dunnett’s T3检验。
2 结果
2.1 MDA含量变化
与A组比，B、C组MDA含量明显升高(P<0.05)，与B组比，C组低，差异有显著性(P<0.05)(见表1)。
2.2 NO及NOS含量变化
与A组比，B、C组NO及NOS含量明显升高(P<0.05);C组的NO及NOS含量与B组比差异有显著性(P<0.05)(见表1)。
2.3 IL-6含量变化
与A组比，其余二组IL-6含量明显升高(P<0.05);C组的IL-6含量与B组比差异有显著性(P<0.05)(见表1)。
2.4 睾丸组织病理学比较
与A组比，B组和C组生精上皮层数、MSTD、睾丸组织结构评分差异均有显著性(P<0.05)。与B组比，C组在MSTD和组织结构评分上差异均有显著性(P<0.05)(见表2)。A组生精上皮均紧贴精细小管生长，排列紧密、有序。B组精细小管结构不连续，损伤明显，管腔内有大量渗出。生精上皮层排列紊乱，仅基底层较明显，其余生精上皮层或缺失，或脱落，且见毛玻璃样改变。C组精细小管结构完整，生精上皮层尚紧贴精细小管排列，虽然排列略显紊乱，但层数仍可辨认(见图1)。
3 讨论
单侧睾丸扭转复位后对侧睾丸生精功能是否会受到损害，目前尚未有公认一致的结果。 有学者认为早期对侧睾丸无损害[4];多数学者则认为对侧睾丸早期即可出现病理性改变[5-]。 MDA作为细胞膜脂质受氧自由基攻击后的产物，可以间接反映体内自由基的生成量。在本实验中，睾丸扭转/复位组MDA含量明显增多，提示睾丸组织内自由基过量，表明睾丸组织存在脂质过氧化损伤。IL-6作为细胞因子之一，参与炎症机制，是炎症反应和免疫反应的产物。睾丸扭转/复位组IL-6含量明显增加，表明睾丸组织存在明显的炎症反应。同时病理形态学发现局部睾丸组织出血水肿、炎症细胞浸润、上皮细胞排列紊乱，睾丸组织结构评分明显高于A组，而生精上皮层计数与精细小管直径都明显低于A组，进一步提示对侧睾丸存在组织损伤且预后不良。
单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能损伤机制较为复杂，争议较多[8]。近年来不少学者认为对侧睾丸早期损伤是由于扭转侧睾丸复位后再灌注引起的[9-10]，再灌注时NO、氧自由基等的增多均可直接或间接引起对侧睾丸组织损伤。其中，过量 NO的损伤作用占了主导地位[11]。当单侧睾丸扭转复位后，一方面扭转侧生成过量的NO与氧自由基结合形成更具毒性的ONOO-，导致对侧睾丸组织的损伤;另一方面通过NO的促炎症递质聚集、过度扩张血管、诱导细胞凋亡等作用于对侧睾丸组织;同时，上述损伤由于超过了机体自身的抵抗能力，会激活更多的NOS致NO大量合成，造成更大的组织损伤。
L-NMMA为非选择性NOS的拮抗剂，对诱生和固有型NOS活性都有抑制作用，能抑制NO产生，目前是用于治疗缺血再灌注损伤的常见药物之一。在本实验中，L-NMMA组NO及NOS含量与睾丸扭转/复位组相比明显降低，表明L-NMMA能抑制NOS活性，减少睾丸组织生成过量NO。同时L-NMMA组的MDA及IL-6含量与睾丸扭转/复位组相比也明显减少，且病理学上表现为睾丸组织结构评分降低及平均曲细精管直径相对升高，说明L-NMMA组大鼠睾丸组织局部炎症反应较轻，睾丸生精功能相对较好。这也进一步证实应用L-NMMA，可以通过抑制NO及NOS的产生，减轻单侧睾丸扭转复位后对侧睾丸的早期损伤，从而对对侧睾丸起到一定的保护作用。
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