雪旺细胞构建人工神经在大鼠长段 神经缺损中的修复作用研究

　　作者：李伯休 陈峥嵘 作者单位：复旦大学附属中山医院骨科，上海 200032

　　【摘要】 研究雪旺细胞与PLGA构成的组织工程化人工神经修复大鼠周围神经缺损的效果。[方法]将雪旺细胞接种在内置polyglactin 910纤维的PLGA中空管，构建成组织工程人工神经。将60只SD大鼠随机分3组，每组20只，建立大鼠坐骨神经缺损20 mm的动物模型。A组用切下的自体神经段原位缝合，B组使用雪旺细胞组织工程人工神经进行修复，C组用未接种雪旺细胞的PLGA中空管进行修复。术后8、12周使用神经电生理和组织学观察分别进行效果评价。[结果]在大体观察、组织学观察中，B组的恢复表现与A组相近。在神经电生理检测、小腿三头肌肌肉重量测定、桥接物横切面神经纤维数量测定的结果分析中B组略低于A组但明显高于C组。B组大鼠桥接段远端辣根过氧化酶示踪后在脊髓前角可以看到被标记的神经元。透射电镜可见B组桥接物中段大量的再生神经纤维。[结论]用雪旺细胞和PLGA构建组织工程人工神经修复大鼠外周神经缺损，可以修复20 mm的长段周围神经缺损，并可获得接近于大鼠自体神经修复的效果。

　　【关键词】 人工神经 长段缺损 神经修复

　　Research of long peripheral nerve defect repair with artificial nerve composed with Schwann cell∥CHENG Biao, LI Bolin, CHEN Zhengrong.Department of Orthopedics, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032,China

　　Abstract：[Objective]To study the effect of repairing of rat peripheral nerve defect with engineering artificial nerve composed with Schwann cells and poly lactic glycoli aced(PLGA). [Method]Human Schwann cells were vaccinated into PLGA tube with polyglactin 910. Sixty SD rats were divided into 3 groups randomly with 20 rats in each one: group A, self-nerve graft; group B, Schwann cells artificial nerve; group C, pure PLGA. Evaluations of electrophysiological and histological examines were carried out 8 weeks ad 12 weeks after operation.[Result]The outcome of group B showed similar to group A in general and histological study, however it expressed slightly lower in electrophysiological study, muscle weight and nerve fiber quantity. Marked neuron could be found in spinal cord after group B had been traced. Large number of regeneration nerve fibers could be seen from electron microscope.[Conclusion]The tissue engineering artificial nerve composed with Schwann cells is able to repair 20 mm defects of peripheral nerve, and it has an approximate treatment effect to the self-nerve grafting.

　　Key words：artificial nerve; long defect; nerve regeneration

　　人工神经是由支架材料和种子细胞、细胞外基质以及诱导和促进生长的因子等几部分组成的有机统一体，在外周神经损伤修复中有重要的研究意义。雪旺细胞(Schwann cell)是其中最重要的种子细胞。经培养和纯化后的雪旺细胞在支架内类似于Bungner带样有序分布，并且分泌多种神经营养因子，支持引导轴突的再生，是提高修复神经缺损效果的关键[1,2]。目前国内外多用新生鼠、兔等动物的周围神经原代培养雪旺细胞构建人工神经。本实验采用内置polyglactin 910的聚羟基乙酸-聚乳酸(PLGA)导管制备三维多孔支架，通过接种人胚雪旺细胞，经体外诱导培养，构建人工神经，并桥接于大鼠坐骨神经缺损处，与自体神经移植作对照，研究并评估其对大鼠外周神经修复的效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂、材料和仪器

　　polyglactin 910(聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物纤维，美国强生公司);PLGA导管(聚乳酸聚羟基乙酸共聚体，中国科学院);抗S-100单克隆抗体(Sigma公司);20%胎牛血清DMEM(Gibaco公司);鼠尾胶(自制);0.1 g/mL盐酸氯胺酮注射液;20～40 mg/mL辣根过氧化酶液;DAB-H2O2作用液;3,3′-二甲基联苯胺(DAB)5 mg，0.05 mol/L Tris-HCL缓冲液(pH值7.6)10 mL，H2O2(30%)1μl。

　　引产3～4个月婴儿死胎6个;3个月龄SD大鼠32只，体重200～250 g;SXP-1B手术显微镜;Leica冰冻切片机;Leica DMIRB图像分析仪。

　　1.2 组织工程人工神经的制备

　　1.2.1 取胎儿外周神经，仔细剥离神经外膜，剪成0.5～1 mm3小块，置于3.5 cm培养皿中，使用反复植块法和差速贴壁法获得纯度较高的雪旺细胞悬液，细胞数量约在5×104。

　　1.2.2 将鼠尾胶包埋polyglactin 910纤维(直径12 μm，长度2 cm)，置入培养皿中，每10～12根纤维中心相互重叠呈放射状排列。使用直接植块法将人胚雪旺细胞接种于polyglactin 910纤维上。20%胎牛血清DMEM，37℃、5%CO2培养，备用。

　　1.2.3 将20 mm长度的PLGA导管预涂鼠尾胶后加入雪旺细胞悬液。37℃、5%CO2培养2周后，移入polyglactin 910纤维，构建成人工神经导管，继续培养2 d，准备植入。

　　1.3 动物实验

　　将60只SD大鼠随机分3组，每组20只。A组用自体神经段原位缝合;B组用组织工程人工神经修复;C组用无雪旺细胞的PLGA中空管。腹腔注射氯胺酮200 mg/kg麻醉大鼠，常规消毒铺洞巾后作股后侧切口，暴露坐骨神经，显微尺测量下切除坐骨神经18 mm，自然回缩后造成20 mm的神经缺损。远侧断端距腓肠肌边缘约5 mm，用10°的带针缝线在10倍手术显微镜下，将桥接物与两侧神经断端的外膜缝合。关闭伤口，按实验动物标准饲养12周。术后第8周各组随机取10只大鼠进行观察，第12周对各组剩下10只大鼠进行观察。

　　1.4 统计分析

　　采用SPSS 12.0软件对实验中各组数据进行分析，P<0.05时认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 一般观察

　　术后观察伤口愈合情况、大鼠的精神状态、步态以及足部溃疡情况等。术后1周伤口基本愈合，各组大鼠均出现明显跛行。2周时各组大鼠均出现患肢足跟溃疡。12周时，A、B组大鼠患肢足跟溃疡基本愈合，但患肢仍跛行;C组患肢足跟溃疡未愈合，患肢肌肉明显萎缩。

　　2.2 植入物观察

　　第8、12周时，切开伤口进行观察。发现各组大鼠取材神经干呈乳白色连接远端神经，没有发现吻合口的断裂。A、B组再生神经直径较粗，神经近端未见神经瘤形成，表面可见清晰的血管，同周围组织均有黏连，但可以分离。B组PLGA管已基本降解。C组近端增粗，远段略塌陷，与周围肌肉组织轻度黏连，PLGA导管几乎完全降解吸收，神经没有长入远端。

　　2.3 神经电生理检测

　　采用Esaote Biomedica Phasis肌电测定系统，输出电刺激为单脉冲方波，电压2～5 V，时间0.01～0.02 ms。用2个双极保护电极作为刺激电极分别作用于桥接段的近侧端和远侧端，以圆心针单极电极插入腓肠肌肌腹中部，记录再生神经混合传导速度(m/s)、复合动作电位峰值(mV)。术后第8、12周，A、B组都有神经传导通过，在吻合口的远端都可以记录到肌电图，肌电图测量2组传导速度和动作电位的振幅都较对侧正常神经有所下降。C组不能引出神经再生的动作电位，只有大量的失神经电位。术后第8、12周各组电生理检测的结果分别列在表1、2，与A组相比，B组神经传导速度较慢，复合动作电位的峰值较低，两组间的差别有显著性(P<0.05)表1 术后第8周各组动物电生理检测

　　2.4 辣根过氧化酶示踪

　　术后12周，再次手术暴露出坐骨神经和人工神经移植段，在人工神经桥接段的远端1 cm的神经干内注射30%的游离辣根过氧化酶液1 μl，继续饲养48 h后，在深度麻醉下经心脏灌注4%多聚甲醛固定，取出L4、5脊髓，做冰冻切片，片厚40 μm，用TMB(3，3，5，5，-四甲基联苯胺)呈色，中性红复染，光镜下观察背根神经节和脊髓前角神经元，在同侧脊髓前角可以看到HRP标记的呈棕色的神经元(图1)。

　　2.5 小腿三头肌肌肉测量

　　术后第8、12周取大鼠术侧小腿三头肌，吸取血迹，在分析天平上称肌肉重量。各组大鼠小腿三头肌肌肉较健侧明显萎缩，平均肌肉重量A组高于B组，B组高于C组，且差异有显著性(P<0.05)(表3)。表3 术后各组大鼠小腿三头肌重量的比

　　2.6 组织学观察

　　术后第8、12周，在显微镜下取出桥接物。分别选择近侧吻合口段、桥接体中段、远侧吻合口段取材，横向连续切片，作HE染色和甲苯胺兰染色，光镜下观察神经再生和髓鞘形成情况。普通光镜下，近端吻合口各组均有再生神经纤维通过，A组再生神经纤维排列致密，髓鞘清晰可见;B组再生神经排列较为整齐，呈束状，可见丰富的新生血管穿插于其间;C组再生神经纤维较为杂乱，有较多的纤维组织增生。在桥接体中段，A组再生神经排列整齐;B组再生神经束较稀疏，但未见瘢痕形成或淋巴细胞侵润;C组再生神经纤维杂乱无章在远端吻合口，A、B 2组仍有较多的再生神经纤维通过(图2);C组则没有。B、C 2组近、中、远三段均未见有polyglactin 910纤维残留。

　　2.7 图像分析

　　将术后12周各组甲苯胺兰染色切片(图3)置于图像分析仪的显微镜下，采用Leica QWin 2.8图像分析系统，对桥接体中段进行测量分析，统计中段的再生神经纤维数目、再生神经束面积及神经纤维密度列于(表4)。

　　图像分析显示B组再生神经中段在再生神经纤维数目与神经纤维密度两方面计数均少于A组，差别有显著性(P<0.05)。移植段中点再生神经纤维的面积B组要大于A组(P>0.05)。C组在再生神经纤维数目与再生神经束面积两方面均明显低于A、B 2组，差别有显著性(P<0.05)。这与光镜下HE染色切片观察到神经再生情况相吻合。表4 术后12周各组桥接物中段横切面图像分析

　　2.8 透射电镜观察

　　术后12周，取移植中段再生神经，DHanks液洗涤，2%戊二醛固定2 h，4℃下DHanks液洗涤2次，1%锇酸固定2 h，乙醇逐级脱水，618环氧树脂包埋，LKB-V超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，用Philips CM120透射电镜拍片，观察神经再生和髓鞘形成情况。术后第12周，B组桥接物中段可见大量的再生神经纤维，髓鞘形成良好(图4)。

　　图1 B组大鼠脊髓前角HRP标记的神经元×200 图2 B组远端吻合口 HE×100 图3 B组中段甲苯胺兰染色×400 图4 B组再生神经纤维周围有雪旺细胞围绕×10 000

　　3 讨 论

　　Aguayo等1979年首先将体外培养的乳鼠雪旺细胞种植到5 mm长的血管段中，用于桥接大鼠坐骨神经缺损，6周后发现有大量再生神经纤维，为组织工程人工神经的研究奠定了基础。

　　2002年Evans等[3]用左旋聚乳酸导管种植同种异体的雪旺细胞修复大鼠12 mm神经缺损，2、4个月时检测神经修复的各项指标和同源雪旺细胞移植疗效相当，但是比自体神经移植效果略差。同年Mosahebi等[4]用聚羟基丁酸戊酯导管种植同种异体雪旺细胞，发现在6周时同种异体雪旺细胞受到排斥，但神经轴突的长入情况与同源细胞移植相似，并且没有导致有害的免疫反应。国内，2002年程飚[5]将成年兔雪旺细胞种植在医用生物膜和polyglactin 910纤维上，桥接2.5 cm长坐骨神经缺损，表现出与自体神经移植相当的疗效。2002年顾晓松等[6]用壳聚糖套管和聚乙醇酸纤维制成人工组织神经移植物，辅加促神经生长的中药有效组分，成功修复大鼠10 mm坐骨神经缺损。

　　虽然大量动物实验显示用神经导管能有效修复短距离神经缺损[7]，但目前还没有一种能够在临床上代替自体神经移植。受神经趋化和接触引导的限制，人工神经桥接的距离一般不超过30 mm，而临床上面临的主要问题是长段缺损时自体神经的来源不足[8]。

　　通过转基因技术，增强人工神经所负载的雪旺细胞的功能，有希望增加桥接的距离。1998年Menei等[9]发现经基因改良能分泌人BDNF的雪旺细胞可促进大鼠神经的轴突再生。冯世庆等[10]用脂质体转染法将含NGF和BDNF表达基因的质粒导入雪旺细胞，4周后神经营养因子的表达明显增加。电镜下可见到转染后的雪旺细胞内含丰富的粗面内质网和线粒体。陈礼刚等[11]证实转有pSVPoMcat微基因的雪旺细胞能稳定分泌21.5 KuMBP。Joung[12]等用腺病毒转染lacz基因到雪旺细胞上，基因持续表达5周以上。但是转基因技术的应用，要充分考虑到可能产生的不良后果。

　　国内张琪[13]等曾将成人副神经埋于裸鼠皮下模拟瓦氏变性处理，体外培养成功获得人雪旺细胞。另一方面利用大鼠自体雪旺细胞构建人工神经的实验[14]也得到成功。本实验采用引产死胎外周神经作为雪旺细胞来源。3～4个月胎龄时，神经系统发育尚不充分，髓鞘尚未成熟，接种后雪旺细胞量大且容易生长。且胚胎神经材料与成人神经相比，所含结缔组织成分较少，神经外膜更易剥离。

　　本实验中将polyglactin 910纤维植入PLGA可降解导管中，构建雪旺细胞的三维生长空间，有利于细胞和周围物质之间的交换，促进其分裂增殖。在评估神经再生情况时，除使用电生理方法外，同时通过活体肢体功能观察、靶器官肌肉测量以及辣根过氧化物酶示踪来综合判断损伤神经修复后靶器官的功能恢复情况。这样评估能较全面的对电生理的结果进行补充支持，避免仅用电生理评估造成的偏差。

　　受损神经修复再生时，许多小轴突常常在通过吻合口后就中止于微神经瘤，这就会使再生神经横断面图像分析的结果与实际功能的恢复程度不一致。本实验分别选择近侧吻合口段、桥接体中段、远侧吻合口段取材，切片染色后，光镜下观察神经再生和髓鞘形成情况。并对再生神经的纤维数目、再生神经束面积以及有髓神经纤维密度进行统计学分析，能较全面的评价神经再生的效果。

　　从本实验结果可以看出：在修复大鼠外周神经缺损中，人胚雪旺细胞人工神经的修复效果与大鼠自体神经移植相近，且明显高于空白管对照组。从近端切口往离心方向，距离越远神经修复程度越低，可能是近端切口轴浆运输分泌神经生长因子的关系。使用人胚雪旺细胞修复大鼠周围神经缺损可以获得接近于大鼠自体神经移植的效果，表明人雪旺细胞可以引导大鼠神经细胞，并且分泌的生长因子对大鼠神经细胞具有一定作用。可以设想，在修复人体周围神经缺损时，人胚雪旺细胞人工神经可能发挥更好的修复效果。

　　回顾整个实验，通过活体肢体功能观察、靶器官肌肉测量、电生理检测、辣根过氧化物酶示踪、连续组织切片以及图像分析相结合的方法，可以较全面地评价周围神经再生的状况;用PLGA中空管和polyglactin 910纤维负载人胚雪旺细胞构建的人工神经可以修复大鼠20 mm的周围神经缺损，并且具有生物相容性佳，可塑性强，管壁渗透性和降解时间可调控等优点，使人胚雪旺细胞人工神经修复人周围神经缺损成为可能。构建的组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经缺损，可获得接近于自体神经修复的效果。这些特点为将来应用人胚雪旺细胞源组织工程神经修复周围神经缺损奠定了坚实的基础，使其具有更加广阔的发展前景。

　　【参考文献】

　　[1] Fansa H,Keilhoff O. Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects[J].Neurol Res,2004,26(2):167.

　　[2] Siuis N,SchaHer HE, Schulte Eversum C,et al.Nerve regeneration across a 2cra gap in the rat median nerve using a resorbable nerve conduit filled with Schwann cells[J].J Neurosurg, 2005, 103 (6): 1067.

　　[3] Evans GR,Brandt K, Katz S. Bioactive poly(L-lactic acid)conduits seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration[J]. Biomaterials,2002, 23:841.

　　[4] Mosahebi A,Fuller P, Wiberg M. Effect of allogeneic Schwann cell trans-plantation on peripheral nerve regeneration[J].Exp Neurol,2002,173:213.

　　[5] 程飚，陈峥嵘.组织工程化人工神经构建的方法研究[J].中国矫形外科杂志，2002，9(5)：456-459.

　　[6] 王晓冬，顾晓松，张沛云，等.人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的实验研究[J].解剖学报，2002,2：131.

　　[7] 杜劲松，王剑，张信英.骨髓源神经干细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2005,13：764.

　　[8] Evans GR.Challenges to nerve regeneration[J].Semin Surg Oncol,2000,19：312.

　　[9] Manei P，Montero-Menei C,Whittemore SR,at al.Schwann cells genetically modified to secrete human BDNF promote enhanced axonal regrowth across transected adult ratspinalcord[J].Eur J Neurosci,1998,10：607.

　　[10]冯世庆，郭世绂，陈君长，等.神经生长因子和脑源性神经营养因子基因转入雪旺细胞的实验研究[J].中华骨科杂志，2000,20：488.

　　[11]陈礼刚，高立达，毛伯镛，等.移植pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞在鼠脊髓内长期存活及其基因表达[J].中华创伤杂志,2001，17：86.

　　[12]Joung I，Kim HS，Hong JS，et al.Effective gene transfer into regenerating sciatic nerves by adenoviral venom：potentials for gene therapy of peripheral nerve injury[J].Mol Cells,2000,31：540.

　　[13]张 琪，顾晓明，毛天球.外周神经缺损的组织工程修复方法的实验研究：首次成人雪旺细胞的体外培养[J].现代康复,2001，10：61.

　　[14]陈 明，夏仁云.构建生物人工神经修复周围神经缺损的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2003,11：536.