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《神经内科》

神经生长因子(NGF)对原代培养的胚胎中脑神经细胞缺氧反应的影响

发表时间:2011-06-24  浏览次数:375次

   作者:宗惠花 陆洲 周留正 汤亚文 端礼荣 张志坚 作者单位:江苏大学附属宜兴医院,江苏 宜兴 214245;江苏大学医学院;江苏大学附属医院 江苏 镇江 212001

  【摘要】 目的: 观察不同浓度神经生长因子(nerve growth ractor ,NGF)对大鼠胚胎中脑神经细胞缺氧的保护作用方法: 采用MTT比色法测定NGF对缺氧神经细胞活性的影响、分光光度法检测丙二醛((MDA),同时进行形态学观察。结果: 各浓度NGF均对大鼠胚胎中脑神经细胞缺氧损伤具有保护作用,NGF能明显降低缺氧所增加的MDA含量,且能减轻细胞的形态学损伤。结论: NGF能降低MDA含量,对大鼠胚胎中脑神经细胞缺氧损伤具有明显的保护作用。

  【关键词】 胚胎中脑神经细胞 缺氧 神经生长因子 丙二醛

  nEffect of nerve growth factor(NGF) on the embryo mediocerebrum neurocyte at primary cultured rats in anoxia

  ZONG Huihua, LU Zhou, ZHOU Liuzheng, TANG Yawen, DUAN Lirong, ZHANG Zhijian

  (The Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University,Yixing Jiangsu 214245; Medical College of Jiangsu University, The Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001,China)

  [Abstract] Objective: To investigate the effect of NGF on the embryo mediocerbrum neurocyte at primary cultured rats in anoxia. Methods: The embryo mediocorebrum neurocyte at the Wistar rats were cultured,which were randomly dividid into three groups.contral group,anoxia group and NGFgroup. The MDA concentration and the cell survival rate were assayed. Results: The MDA contents were significantly increased at anoxia group as compared with that at control group.NGF could obviously reduce the MDA contents and enhance cell survival rate in anoxia group. Conclusion: NGF could toleate suffering from anoxia at embryo mediocerebrum of primary cultured rats and decrease MDA concentration in some extent.

  [Key words] embryo mediocerebrum neurocyte; anoxia; NGF; MDA

  神经生长因子(Nerve Growth Factor ,NGF)是迄今为止发现的惟一对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子。缺氧对神经细胞产生极大的损伤作用[1],在缺氧状态下,神经细胞NGF表达明显减少[2]。中脑是脑内对缺氧最为敏感的部位之一,体外神经细胞缺氧模型是研究缺氧神经细胞损伤的重要工具,通过该模型可直观分析NGF对缺氧大鼠中脑神经细胞保护作用。本研究采用体外细胞培养方法,通过测定细胞存活率和丙二醛(MDA)的含量,观察不同浓度NGF对大鼠中脑神经细胞缺氧损伤的保护作用。

  1 材料与方法

  1.1 主要试剂和仪器

  小牛血清(杭州四季青生物公司);F12培养基为(美国Sigma公司);NGF(纯度95%);MTT(3[4,5二甲基磺胺噻唑]2,5二苯基四唑溴蓝);SDS(十二烷基磺酸钠)均为(美国Sigma);其他化学试剂均为国产分析纯。CO2培养箱为(Forma Scientic,USA);ELx800酶标仪(美国BIOTEK公司)。

  1.2 实验动物及分组

  16 d孕鼠(江苏大学医学院实验动物中心提供),体质量250~300 g,随机分为正常对照组,单纯缺氧组,缺氧加NGF组。

  1.3 胚胎中脑神经细胞的制备

  用脱颈椎法处死妊娠16 d孕鼠,在无菌条件下分离出胎鼠中脑,浸入37℃的胎牛血清.Hanks平衡液(1∶1v/v)5~10 min,用Hanks液漂洗3次后,用0.125%胰蛋白酶消化30 min,加入小牛血清终止消化后经200目钢丝网筛过滤,离心洗去胰蛋白酶。加入DMEM培养液(内含50 U/ml的青霉素,50 μg/ml的链霉素和20%小牛血清)制备细胞悬液,计数细胞存活率,采用台盼蓝计数活细胞。结果活细胞率为92%,再用含10%小牛血清的F12培养基将细胞密度调整至4×106个细胞/L的细胞悬液。种入预先铺好多聚赖氨酸并已干燥的96孔培养板内。放入5%CO2培养箱(相对湿度100%、温度37℃),48 h后加入阿糖胞苷,终浓度为10 μmol/L。培养至第6天将细胞置入缺氧罐中(95%N2,5%CO2)24 h,然后再把细胞放回5%CO2培养箱中2 h。

  1.4 细胞形态及集落形成的观察

  正常对照组:胎鼠中脑神经细胞密度调整至4×106个细胞/L,未经缺氧处理,未加入干预因子;单纯缺氧组:经缺氧处理,未加入干预因子;缺氧加NGF组:缺氧前30了min加入NGF各1.0,5.0,10.0,50.0,100.0 μg/L,每组平行样本数为8。用等渗2.5%戊二醛固定,然后用苏木精染色,再放入37 ℃培养箱内孵育过夜,次晨用磷酸缓冲液(PBS)冲洗2次,在倒置显微镜下观察染成蓝色的胚胎中脑神经细胞和集落形态,随机计数50视野内中脑神经细胞,计算出集落形成率(±s)并以正常对照组为参照物计算神经细胞集落形成率(正常对照组为100%)。

  1.5 中脑神经细胞活性检测

  将制备好的细胞悬液(配制成4×105 /L)50 μl接种于96孔酶标板内,待细胞贴壁后,弃去上清液,加入供试液150 μl,并设空白对照组,于37 ℃5%CO2孵箱中培养48 h,然后加入MTT液20 μl,继续在37 ℃5% CO2孵箱中培养5 h,取出酶标板后小心吸去每孔内的培养液,加入二甲亚砜(DMSO),混合均匀。用酶标仪于570 nm波长测定光密度值,通过与对照值的比较得到试验组的增殖率。

  1.6 MDA含量测定

  将细胞密度调到4×105 /L的胚胎中脑神经细胞接种于24孔培养板中,胚胎中脑神经细胞分对照组、缺氧24 h组及NGF(1.0,5.0,10.0,50.0,100.0 μg/L)作用6 d后取出中脑神经细胞,经胰酶消化收集各实验组中脑神经细胞,调整细胞密度为3×106/L制成单细胞悬液,离心(4 000 r/min,5min),弃上清液,加0.05 mol磷酸盐缓冲液(pH 7.4)0.05 ml,10%十二烷基磺酸钠(SOD)1 ml混匀沉淀蛋白,20 min后加2.5 ml 0.1 mol/L HCl和1 ml1%TBA显色剂,盖塞于100 ℃沸水浴锅中煮沸40 min,取出流水冷却,加3.5 ml正丁醇振摇3 min,静置10 min,缓慢加入0.5 ml无水乙醇,轻轻旋转数次,再静置5 min,取出上清液待测。分别采用改进的硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[3]。

  1.7 数据处理

  运用Stata7.0统计软件,各组间的差异,采用方差分析和t检验方法。

  2 结果

  2.1 NGF对大鼠胚胎中脑神经细胞形态及集落存活率的影响

  用倒置显微镜观察神经细胞缺氧前后形态变化。对照组神经细胞胞体饱满,光晕明显,有折光性,突起长而完整,细胞相互交织成网状;缺氧组对神经细胞退化、肿胀,细胞突起变少或消失,出现细胞碎片;缺氧加NGF组神经细胞形态基本正常,仅少数细胞肿胀,突起存在,交织成网。 NGF对大鼠胚胎中脑神经细胞集落存活率具有明显保护作用。缺氧24 h后细胞集落存活率明显下降(P<0.05),NGF(1.0,5.0,10.0,50.0,100.0 μg/L)对缺氧中脑神经细胞集落存活率明显升高。详见表1,图1~图4。

  表1 NGF对大鼠胚胎中脑神经细胞集落存活率的影响(略)

  与正常对照组比较,*:P<0.05;与缺氧组比较**:P<0.01

  2.2 NGF对中脑神经细胞MDA含量及MTT活性的影响

  缺氧损伤及NGF对中脑神经细胞活性的影响较大, 缺氧24 h后,与对照组相比MTT值下降明显(P<0.01),而使用不同剂量的NGF均可使细胞凋亡减少,且对中脑神经细胞缺氧损伤的保护程度有剂量依赖关系。由表2可知,NGF对缺氧中脑神经细胞MDA的影响,而在缺氧24 h后,MDA活性明显升高。当NGF剂量为1.0,5.0,10.0,50.0,100.0 μg/L,作用后其活性均明显低于缺氧组。

  图1 正常对照组大鼠胚胎中脑神经细胞形态(×10)(略)

  图2 缺氧24 h组大鼠胚胎中脑神经细胞形态(×10)(略)

  图3 NGF浓度为50.0μg/L时,大鼠胚胎中脑神经细胞形态(×10)(略)

  图4 NGF浓度为100.0 μg/L时,大鼠胚胎中脑神经细胞形态(×10)(略)

  3 讨论

  神经生长因子是最早发现的神经营养因子, 对损伤神经的修复机能有调节作用的生物活性因子,对感觉神经和交感神经细胞的发育、轴索生长以及细胞凋亡等均起着重要的作用[4]。本实验中MTT比色原理是利用活细胞线粒体脱氢酶能将MTT盐还原成蓝紫色甲瓒颗粒,以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性。本研究结果显示,缺氧可造成体外培养的大鼠中脑神经细胞明显死亡,MTT值与对照组相比明显下降,而使用NGF可使细胞死亡减少。MDA是脂质过氧化的产物,在动物脑缺血缺氧过程中,神经细胞膜易受到自由基的攻击而产生较多MDA,而NGF充分发挥抗自由基、抗氧化和神经营养作用[5]。测定培养液MDA的含量可更直接地反映神经细胞的受损程度。

  表2 NGF对中脑神经细胞MDA含量及MTT活性的影响(略)

  与正常对照组比较,*:P<0.01;与缺氧组比较,**:P<0.05,***:P<0.01

  本实验结果表明,缺氧能增加MDA的含量,而NGF可剂量依赖性地减少MDA的含量。实验结果提示,NGF能拮抗缺氧导致的神经细胞损伤及神经细胞膜通透性增加,同时调节神经细胞内脂质过氧化的平衡。因此,NGF对缺氧的中脑神经细胞有明显的保护作用。然而,NGF是通过何种信号传递途径及具体的分子机制,目前尚不是很明确,有待进一步研究。

  【参考文献】

  [1] Yun JK, McCormick TS, Judware R,et al.Ular adaptive responses to low oxygen tension: apoptosis and resistance[J]. Neurochem Res, 1997,22(4):517-521.

  [2] DiLoreto S, Corvetti L, Maccarone R,et al.Interleukin1betamodulates the effects of hypoxia in neuronal culture[J]. Neroimmunol,2000,106(1):32-42.

  [3] 向 荣,王鼎年.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法[J].生物化学与生物物理进展,1990,17(4):241-242.

  [4] LeviMontalcini R,Skaper SD, Dal Toso R,et al. Nerve growth factor:from neurotrophin to neurokine[J].Trends Neurosci,1996,19(11):514-520.

  [5] 陈 瑗,周 玫.自由基医学基础与病理生理[M].北京:人民卫生出版社,2002.50-149.

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