移植肾缺血再灌注损伤的机理及药物防治研究进展

　　作者：薛学义， 高锐(综述), 罗义麒(审校) 作者单位：福建医科大学附属第一医院泌尿外科，福州 350005

　　【关键词】 再灌注损伤; 缺血; 肾移植; 免疫抑制剂; 佐剂，免疫; 整合素类

　　热、冷缺血再灌注损伤(IRI)是影响移植肾早期功能的主要因素，不仅会引起单纯的移植肾功能延迟恢复(delayed graft function，DGF)，还能通过影响免疫机制促进急性排斥(acute rejection，AR)发生。同时，IRI作为一个主要的非抗原依赖性因素，其对移植肾的影响甚至超过HLA配型不合，影响移植物长期有功能存活，在移植物慢性丧失功能的发生发展中起重要作用，因此，如何减轻IRI对移植肾功能的影响是人们一直努力的方向。近年来，人们寄希望于对受者在术前、术后应用药物或在灌洗液中加入药物来防治移植肾IRI，以改善移植肾功能。

　　1 IRI导致肾脏损伤的机理

　　造成肾脏IRI相关因素很多，其中氧自由基过氧化损伤、凋亡、炎症级联反应和免疫学因素起了重要作用。

　　1.1 过氧化损伤 活性氧(reactive oxygen species,ROS)在IRI中起重要作用，介导整个损伤过程。ROS是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程产生的具有很高生物活性的氧分子，如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)等，在IRI时大量产生。ROS可来源于线粒体电子传递系统、环氧化酶、脂氧化酶、内质网混合功能氧化酶和黄嘌呤氧化酶系等多条途径。NO等含氮的复合物与O2-反应产生的过氧化亚硝酸盐也有类似作用[1]。

　　血流减少和缺氧可直接导致重要营养物质缺乏和ATP生成减少，缺氧导致的线粒体功能障碍可使ATP合成进一步减少。ATP下降即可引起内皮和上皮细胞功能障碍、细胞肿胀、游离钙离子增加和磷脂酶活性增加。在低灌流期间，腺苷和次黄嘌呤堆积。腺苷通过其对A1腺苷受体的作用能介导血管收缩;而次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成有毒性的ROS。大量产生的ROS若超过机体的清除能力，耗竭体内还原物质，即可直接损伤组织和诱导细胞凋亡，主要损伤机制如下：(1)ROS可直接与细胞膜不饱和脂肪酸和胆固醇发生脂质过氧化反应，使细胞膜的流动性下降、通透性增高，影响有酶参与的生化过程和离子泵功能。还可通过修饰氨基酸和与肽键反应攻击蛋白质，导致肽链断裂，使蛋白质尤其是酶蛋白丧失活性;也可直接损伤DNA分子而导致细胞凋亡。DNA双链断裂可使包括多聚ADP核糖合成酶(poly ADPribose syntherase，PARS)在内的DNA修复系统活化。PARS的功能是将烟酰胺腺苷二磷酸(NAD)上的ADP核糖单体转运至核蛋白，其过度活化必然导致NAD缺乏，抑制内源性ATP 的产生，从而加重损伤，称为PARS自杀，可能是氧和氮来源的ROS的直接细胞毒作用。动物实验发现，抑制非肾脏细胞和近端小管细胞中的PARS，可显著减轻由ROS导致的损伤。(2)ROS可作用于线粒体内膜上的氧化磷酸化过程。研究发现，线粒体呼吸链复合物Ⅰ和复合物Ⅲ是产生ROS的主要因素，氧化呼吸链的阻断可导致细胞损伤和细胞凋亡[2]。

　　正常状态下，机体的精细调节会自动平衡体内产生的ROS。如体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶等能迅速地清除ROS，防止ROS堆积。SOD酶是抵御氧自由基产生的第一道防线，但肾脏IRI会导致总SOD活性下降，使组织对氧化损伤更加敏感。因此，肾脏IRI不仅使ROS增多，还使其清除机制受到破坏，加剧了过氧化损伤。最近研究发现，导致过氧化损伤的ROS还与慢性移植物肾病相关。研究显示，ROS可激活信号传导级联反应和转录因子，调节一系列引起细胞增殖、细胞外基质重构的基因和蛋白[3]，从而促进移植肾慢性的发生。因此，IRI初期引起的ROS表达可影响移植肾的远期存活质量，推测这可能是移植肾早期IRI损伤影响远期移植效果的途径之一。

　　细胞内低Ca2+浓度是维持细胞正常生理功能的前提。IRI将破坏内皮细胞对Ca2+的自稳调节，使细胞内Ca2+超载，这是导致细胞损伤的关键。再灌注时，Ca2+与细胞质受体钙调蛋白结合后，激活蛋白酶和磷酸酯酶A2，引起膜磷脂水解(其过程伴随有氧自由基的产生)，游离脂肪酸释放，使细胞膜和线粒体膜的结构和骨架破坏，线粒体肿胀导致氧化磷酸化脱偶联，使能量代谢发生障碍。钙离子依赖性蛋白酶的激活，使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤脱氧酶(XO)。再灌注中大量分子O2-在XO催化下，与堆积的次黄嘌呤和黄嘌呤反应，伴随大量氧自由基产生。过量的Ca2+还可以激活中性粒细胞，引起其“代谢爆发”，产生大量氧自由基。氧自由基可使脂质发生过氧化反应，直接损伤细胞膜，导致细胞膜通透性增加，促进新的Ca2+内流，同时氧自由基又可破坏线粒体结构，干扰氧化磷酸化过程，加速ATP等高能磷酸化合物的耗竭，使ATP依赖的离子泵活性下降，其结果也促进了细胞内Ca2+的增加。钙超载与氧自由基的产生是导致肾IRI的重要因素，二者相互影响、协同作用，而导致IRI加重。

　　1.2 黏附分子的作用 在炎症反应过程中，白细胞在血管内皮细胞表面滚动、黏附和穿越内皮移行至炎症部位是白细胞激活和致炎的重要步骤，其分子基础是白细胞与血管内皮表面黏附分子的相互作用及细胞因子对黏附分子表达的调节。活化的炎症细胞和内皮细胞释放ROS和导致肾损伤的酶类，强化细胞黏附，并激活补体系统。这些反应将进一步激活更多的炎症细胞和实质细胞，从而形成一个逐级放大的反应网络，即炎症级联反应。

　　黏附分子是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白。参与炎症反应的黏附分子主要有选择素家族(选择素P、选择素E、选择素L)，白细胞整合素亚家族即β2整合素(CD11a/CD18即LFA1、CD11b/CD18即Mac1、CD11c/CD18即p150,95)和免疫球蛋白超家族(ICAM1、ICAM2、ICAM3、VCAM1)[4]。

　　选择素家族中，选择素L可表达于中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞表面，选择素P通常储存于内皮细胞和血小板的分泌颗粒中，在受炎症刺激后数分钟内可表达于细胞及血小板表面。选择素L、选择素P可通过相应的配体相互作用，介导起始粘附及滚动作用。选择素E受细胞因子刺激后数小时在内皮细胞表面表达达高峰，可锚定在细胞表面继而介导其活化，有助于白细胞稳定地粘附于内皮细胞[5]。

　　整合素中，β2整合素仅限于白细胞上表达，内皮细胞表达的细胞间黏附分子ICAM1、ICAM2、ICAM3及血管细胞黏附分子VCAM1为其配体。作为免疫球蛋白超家族中黏附分子受体之一，ICAM1似乎是早期移植物失功的重要介质，因为其表达具可诱导性，而且是白细胞黏附分子受体中唯一能使中性粒细胞趋化至缺血后组织内的分子。ICAM1组成性低表达于内皮细胞表面，但其表达可因缺血或过氧化损伤而上调，且在热缺血再灌注后上调表达尤为明显。针对ICAM1的反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制IRI所致的组织损伤[6]。

　　1.3 细胞因子的作用 缺血时组织局部炎症介质的产生也将增加，包括TNFα、IL1、补体活化产物、PAF、花生四烯酸的代谢产物及活性氧代谢物等，它们均可使黏附分子表达增强。最近发现，可催化花生四烯酸代谢中关键酶反应的COX2的表达与肾IRI损伤密切相关。TNFα与组织IRI过氧化损伤也密切相关[7]。

　　IL1和TNFα等炎性细胞因子可使选择素表达上调。TNFα利用蛋白激酶C依赖和非依赖途径激活NFκB, 加速细胞黏附分子的转录。研究证实，肾脏缺血30 min后TNFα mRNA 即表达增强。再灌注后、白细胞浸润之前，TNFα水平和生物学活性均增加。而TNFα结合蛋白则可降低TNFα生物活性、减少中性粒细胞浸润、保护肾脏功能，表明局部合成的TNFα是肾脏IRI早期重要的致病因子[8]。此外，阻断TNFα或IL1的产生可减少ICAM1的表达并减轻IRI。

　　此外，IRI虽为重要的非免疫学因素，但越来越多的证据表明，它可和免疫学因素相互影响，增强其作用。因此，研究与IRI相关的免疫学因素成为一个重要的方向，有助于深入了解IRI的损伤机理和效应机制。

　　2 移植肾IRI的药物防治研究

　　2.1 抗氧化剂 氧自由基清除剂和钙离子拮抗剂经临床应用后已证实对肾IRI有一定防治作用。抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、甘露醇、别嘌吟醇、维生素E、N乙酰半胱氨酸、铁螯合剂、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂、巯基还原剂、自由基自旋捕集剂，DMPO和TEMPO等。低分子化合物VitC、VitE、辅酶Q是一些天然抗氧化剂，大多为体内氧化还原反应的辅酶，可通过不同途径阻断脂质过氧化[9]。卵磷脂化的超氧化物歧化酶(lecithinized superoxide dismutase,lecSOD)是一种新型自由基清除剂，与内皮细胞有较高亲和力，能明显抑制中性粒细胞黏附于内皮细胞，而未修饰的重组新细胞个体SOD则无此作用。提示lecSOD有助于保护内皮细胞对抗IRI。Nakagawa等证实了利用超氧化物歧化酶对自由基的清除作用可以减轻肾移植中IRI，改善移植肾的长期存活[10]。褪黑素是松果体合成、分泌的神经内分泌激素，是迄今为止已知抗氧化作用最强的自由基清除。它能中和ROS，直接发挥其抗氧化作用，还可抑制NO合成酶的活性，从而减少了ROS的产生，起到间接抗氧化作用。Yokozawa等发现，甘草根提取物也可防治过氧化损伤[11]。研究发现，脱氢表雄酮和柚甙也能显著减轻肾组织IRI的过氧化损伤。Li Volti等研究发现，血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO)能催化十因子为一氧化碳和胆红素/胆绿素，促进铁离子的释放。他们认为，对于肾脏IRI，外用一氧化碳和胆红素/胆绿素可以刺激HO通路，通过作用于靶基因起到保护肾脏的作用[12]。De Araujo等认为，抗氧化剂N乙酰半胱氨酸可以减少巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，保护肾小管免受IRI[13]。Cicalese等发现，丙酮酸可直接抑制过氧化氢产生，并间接增加抗氧化剂即还原型谷胱甘肽的含量，进而增加谷胱甘肽抗氧化系统的能力[14]。丙酮酸可抑制黏膜组织的损伤、嗜中性粒细胞的浸润以及自由基的生成，从而保护肾脏免受IRI。

　　2.2 抗炎药物 鉴于炎症反应在IRI中的作用，人们试图从抑制炎症反应的角度探索防治肾IRI的措施。因为参与炎症级联反应的因素交叉重叠，所以阻断单一因素不可能减轻肾损伤，彻底消除炎症级联反应才能阻止和治疗肾IRI损伤。许多实验都着眼于抑制炎症介质的释放，干扰炎症介质与受体的结合，抑制白细胞黏附分子合成及与内皮细胞的粘附。在肾IRI中，白细胞粘附首先由E选择素和P选择素介导，二者对其受体PSGL1具有很高的亲和力。P选择素是不需经过转录、在再灌注后5 min 就从内皮细胞的weibepalade小体直接转导至内皮细胞表面的一种黏附分子，最早介导内皮细胞与白细胞的粘附，被认为是肾IRI后炎症反应的始动环节。Takada等在肾冷IRI大鼠模型上将一种可溶性的P选择素糖蛋白配体(sPSGL )加入到冷灌洗液中，以阻断P选择素的作用，再灌注后3 h又静脉注射sPSGL以阻断E选择素的表达，结果治疗组E选择素的mRNA表达水平明显降低，白细胞浸润减半;肾组织中CD4细胞、巨噬细胞、MHCⅡ阳性细胞数明显减少，与T细胞、巨噬细胞相关的细胞因子、黏附分子、生长因子的mRNA表达水平亦明显降低，肾功能、结构均得到明显改善。不仅如此，经过早期治疗的大鼠其远期肾功能亦得到明显改善[15]。应用PAF受体拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、抗ICAM1抗体等减轻IRI前后的炎症浸润，也显示了减轻IRI的作用。

　　Subramanian等研究了甘草酸(HES)对肾IRI的影响，证明其可以减轻兔模型的肾IRI，改善肾功能。因而推测HES可能通过抑制E和P选择素发挥作用[16]。Hofbauer等证明，在体外使用临床浓度的HES可使粒细胞通过内皮细胞层的化学趋化作用减弱[17]。Dieterich等在做内皮细胞培养时也证明，HES可使炎症反应中介导白细胞和内皮细胞间相互作用的黏附分子下调，包括ICAM1。HES减少白细胞在小动脉和小静脉的粘附而没有明显影响白细胞滚动，其抗炎作用可能是主要抑制β2整合素或IgG超家族黏附分子[18]。Hoffmann等的研究表明，HES(130 kD) 对内毒素诱发的微循环障碍有保护作用，可明显下调小动脉和小静脉的白细胞粘附增多，而相应量的晶体溶液(等渗盐水)则不产生这样的保护作用[19]。

　　此外，我国中药如川芎嗪、银杏叶、益生注射液、灯盏细辛制剂、洋金花注射液等是当前植物药开发研究热点之一。这些药物可通过改善肾微循环、清除自由基、抗炎等机制实现其保护作用[20]。因此，从我国天然药物资源中寻找价廉、高效、低毒、能与免疫抑制剂协同作用的IRI拮抗药物，是极具潜力的防治策略之一。

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