吡格列酮诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的实验研究

　　作者：朱绍兴, 陈流, 王彬 作者单位：福建医科大学 附属协和医院泌尿外科,福州 350001

　　【摘要】目的 研究吡格列酮对前列腺癌(Pca)PC3细胞凋亡的诱导作用及其可能机制。 方法 体外培养Pca PC3细胞,以不同浓度(0,0.1,1,10,100 μmol/L)的吡格列酮干预细胞,四氮唑蓝比色法(MTT)和原位细胞凋亡检测法(Tunnel)检验吡格列酮对Pca PC3细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用,流式细胞术检测其对Caspase3表达的影响。 结果 10,100 μmol/L吡格列酮对前列腺癌PC3细胞有显著的抑制增殖及诱导凋亡的作用,其干预组Caspase3表达显著增高，0.1，1.0 μmol/L吡格列酮对前列腺癌PC3细胞无明显作用，其干预组Caspase3表达表明显变化。 结论 吡格列酮可诱导Pca PC3细胞凋亡,作用呈剂量依赖性,其机制可能与细胞内Caspase3的活化有关。

　　【关键词】 噻唑烷二酮类 前列腺肿瘤 细胞凋亡 肿瘤细胞 培养的

　　前列腺癌(prostate cancer,Pca)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,近年来在我国发病率逐年上升。激素依赖性Pca的治疗主要采用内分泌治疗,而激素非依赖性Pca(hormone refractory prostate cancer,HRPC)目前尚缺乏有效的治疗方法。研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferatorsactivated receptorsγ, PPARγ)与Pca关系密切,有望成为预防、治疗Pca的新位点。

　　PPARγ属于核激素受体超家族的成员,主要分布在人体的脂肪组织,目前已发现它在脂肪代谢、介导组织对胰岛素的敏感性、组织炎症、细胞分化和细胞周期的控制中起重要作用。研究表明，PPARγ在正常和良性前列腺增生组织中几乎不表达,而在Pca和前列腺上皮内瘤样病变组织中显著表达[13],提示PPARγ在正常前列腺和Pca组织中的表达存在明显差异。吡格列酮是PPARγ的药理性配体,本研究探讨吡格列酮对PC3细胞凋亡的诱导作用及其可能机制,为临床应用吡格列酮治疗Pca提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 F12培养基(美国Hyclone公司);吡格列酮(北京高博医药化学技术公司);TUNEL试剂盒(中国博士德生物公司);MTT试剂(美国Biotium公司),Caspase3 active kit(美国BD公司)。PC3细胞(西安医科大学附属第一医院泌尿外科研究室惠赠)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 分组 对照组(二甲基亚枫,DMSO组)和吡格列酮组(0.1,1,10,100 μmol/L 4个亚组)。

　　1.2.2 PC3细胞形态学观测 在含10%胎牛血清的F12培养基中生长,置于37 ℃、饱和水蒸气、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞,0.25%胰蛋白酶常规消化后以每瓶1.5×105接种于25 cm2细胞培养瓶,培养24 h 后吸除原培养液,加入含吡格列酮浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 μmol/L的F12培养液(无血清培养液)5 mL,处理 24,48,72 h,每天用倒置显微镜观察并照相记录细胞形态变化。

　　1.2.3 四氮唑蓝比色法(MTT分析法)测定吡格列酮对 PC3的生长抑制效应 取对数生长期的PC3细胞,0.25%胰蛋白酶常规消化后以每孔3×103接种于96孔培养板,培养24 h 后加入含吡格列酮的F12培养液180 μL,使吡格列酮终浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 μmol/L,每个浓度做5孔。将各组细胞继续培养24,48,72,96 h后,每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL,相同条件下继续培养4 h。用酶标仪在490 nm 波长处测定各孔的吸光度A 值(A490)。按下列公式计算细胞存活率。

　　细胞存活率R= 实验组平均A值/对照组平均A值×100%

　　实验重复2次。

　　1.2.4 TdT酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测原位细胞凋亡 取对数生长期 PC3细胞约每孔6×103接种于预先多聚赖氨酸处理玻片的6 孔培养板中,培养24 h后加入含吡格列酮终浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 μmol/L的F12培养液继续培养48 h,每一浓度做5孔。取出玻片,做好标记,按实验说明书操作,倒置显微镜下随机计数5个视野,每个视野计数200个细胞,以细胞内出现棕色颗粒者为凋亡细胞,计算凋亡细胞的阳性率。

　　1.2.5 流式细胞术检测Caspase3活性 将Pca PC3细胞以每瓶1.5×105接种于25 cm2细胞培养瓶,共计10瓶,培养24 h 后加入含吡格列酮终浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 μmol/L的F12培养液5 mL,每种浓度各2瓶分2组,一组为检测组,一组作同型对照,处理 48 h。按Active Caspase3 Apoptosis Kit说明书测定Caspase3活性。每个样本约检测104个细胞,用同型对照组检测值扣除本底,阴性对照组确定阴性范围。采用MultiCycle for Windows 软件进行分析。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行分析。组间检验用t检验,P<0.05表示差别有统计学意义,P<0.01 为差别有显著性统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 吡格列酮诱导Pca PC3细胞凋亡的形态学变化 正常情况下PC3细胞为低分化腺癌细胞,贴附生长于培养瓶上,细胞形态较不规整,呈梭形、多角形,细胞之间相互衔接或镶嵌状致密排列。10 μmol/L吡格列酮作用于Pca PC3细胞24 h,即可看见少量细胞变圆,48 h后细胞之间距离增大,变圆的细胞数量增多,可见到细胞凋亡特征性的形态学变化,细胞皱缩,染色质凝集,核固缩碎裂,有凋亡小体形成,并可见细胞脱落悬浮于培养基中,部分细胞体积增大,膜破裂呈细胞坏死状。上述变化与吡格列酮的浓度、作用时间呈剂量依赖性(图1)。

　　A：对照组细胞形态不规整，呈梭形、多角形，细胞之间相互衔接或镶嵌状致密排列; B：0.1 μmol/L吡格列酮组细胞形态与A组相比未见明显变化; C：1 μmol/L吡格列酮组细胞之间距离增大，呈椭圆形或圆形，凋亡特征不明显; D：10 μmol/L吡格列酮组细胞排列疏松，细胞皱缩，染色质凝集，核固缩碎裂，有凋亡小体形成; E：100 μmol/L吡格列酮组可见大量凋亡小体形成，部分细胞体积增大，膜破裂呈细胞坏死状.

　　图1 吡格列酮作用48 h后的PC3细胞形态学表现(×200)(略)

　　Fig 1 Morphologic features of PC3 cells following 48 hours of pioglitazone treatment

　　2.2 吡格列酮对Pca PC3细胞的生长抑制效应 MTT法检测结果显示，0.1，1.0 μmol/L吡格列酮对Pca PC3细胞的增殖无明显影响,10 μmol/L吡格列酮作用48 h后则明显降低Pca PC3细胞的存活率(P<0.05,n=5),随着药物浓度的增加和时间的延长,作用愈加明显(表1)。

　　2.3 吡格列酮诱导PC3细胞凋亡的作用 凋亡细胞在光镜下表现为细胞核棕色浓染(图2)。原位细胞凋亡检测结果显示,0，1，1.0 μmol/L吡格列酮对PC3细胞无明显诱导凋亡的作用;10，100 μmol/L吡格列酮则对PC3细胞有显著的诱导凋亡作用,作用48 h后凋亡细胞阳性率分别达41.66%和65.34%(与对照组比较，P<0.05,n=5)。

　　2.4 流式细胞术检测Caspase3活性 0.1、1 μmol/L吡格列酮作用48 h后,PC3细胞Caspase3活性无明显增强,10、100 μmol/L吡格列酮作用48 h后活化Caspase3细胞阳性率分别为56.36%和75.34%(与对照组比较，P<0.05,n=5)。

　　表1 不同浓度吡格列酮处理细胞后细胞存活率(略)

　　Tab 1 Cell survival rate following treatment of different concentrations of pioglitazone

　　n=5. 与对照组比较,☆:P<0.05.

　　A：对照组为正常形态PC3细胞; B：0.1 μmol/L吡格列酮组细胞形态与A组相似; C：1 μmol/L吡格列酮组少量细胞核内出现棕色浓染颗粒; D：10 μmol/L吡格列酮组核内出现棕色浓染颗粒的细胞增多; E：100 μmol/L吡格列酮组可见大量核内出现棕色浓染颗粒的细胞.

　　图2 吡格列酮作用48 h后PC3细胞TUNEL检测结果(×200)(略)

　　Fig 2 TUNEL results of PC3 cells following 48 hours of pioglitazone treatment

　　3 讨论

　　3.1 PPARγ抗肿瘤机制 PPARγ生物学功能复杂多样,在调控脂肪和糖代谢、单核细胞分化、诱导肿瘤细胞分化和凋亡中都起了重要作用。PPARγ配体激活PPARγ后具有抗肿瘤、促进细胞分化、诱导细胞凋亡的作用[4]。目前研究认为, PPARγ作用于肿瘤细胞的可能机制在于：(1)使肿瘤细胞周期停滞于 G1期,抑制其增殖;(2)PPARγ的激活剂,包括天然激活剂15dPGJ2、抗糖尿病药物TZDs和前列腺素等可以通过细胞核内的PPARγ受体,抑制 VEGF的表达,从而抑制肿瘤血管的生成;(3)PPARγ促进肿瘤细胞大量表达细胞分化标志物 IPA和 villin,诱导细胞分化[57]。

　　3.2 吡格列酮对Pca PC3细胞增殖和凋亡的影响 PPARγ配体可分为生理性配体和药理性配体。生理性配体是从前列腺素D2衍生的一系列产物,药理性配体包括噻唑烷二酮类药物(TZDs)如吡格列酮、罗格列酮等,以及某些非甾体类抗炎药如布洛芬。TZDs是一类新型的胰岛素增敏剂,可单独或与磺脲类、双胍类药物联合治疗2型糖尿病,它也是PPARγ的合成配体,能与PPARγ竞争性结合。本实验结果显示,吡格列酮有显著的诱导凋亡作用,且呈药物浓度依赖性,提示吡格列酮具有潜在的抗Pca作用。

　　3.3 吡格列酮对Pca PC3细胞Caspase3活性的影响 Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族, 其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。Caspase平时以无活性的酶原形式存在于细胞质中, 诱导细胞凋亡的各种信号可能通过不同的信号传导系统激活Caspase,使其裂解维持细胞生存的蛋白,从而导致细胞死亡。Caspase的激活通路按照启动酶活性信号的起源分成细胞外和细胞内通路,细胞外通路通过死亡受体,细胞内通路通过线粒体[8]。Caspase3在细胞凋亡中处于关键地位,是凋亡执行者,一旦激活,凋亡不可避免。本实验显示,低浓度(0.1,1.0 μmol/L)吡格列酮对Pca PC3细胞Caspase3活性无明显影响,高浓度(10，100 μmol/L)吡格列酮可明显增加Caspase3活性,提示细胞内Caspase3的活化可能是吡格列酮诱导Pca细胞凋亡的机制之一。

　　【参考文献】

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