DIM联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞的抑制作用

　　作者：匡幼林 翁小东 陈志远 刘修恒 祝恒成 江波涛 作者单位：武汉大学人民医院泌尿外科， 湖北 武汉 430060

　　【摘要】目的 探讨3,3二吲哚基甲烷(DIM)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对前列腺癌细胞的抑制作用。方法 CCK8法测定DIM、TRAIL及DIM联合TRAIL作用于PC3细胞后的细胞生存率，同时用流式细胞术测定细胞凋亡率，Western印迹检测caspase3表达水平的变化。结果 各给药组与对照组比较均能不同程度抑制PC3细胞增殖并诱导其凋亡，且caspase3表达上调;DIM与TRAIL联用明显增强诱导凋亡作用。结论 DIM与TRAIL联用均可明显增强PC3细胞抑制效果和诱导凋亡作用，其凋亡作用机制可能与其上调caspase3表达有关。

　　【关键词】 前列腺癌;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;3,3二吲哚基甲烷;细胞凋亡

　　Inhibitory effect of DIMTRAIL on the prostate cancer cells

　　KUANG YouLin, WENG XiaoDong, CHEN ZhiYuan, et al.

　　Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of 3, 3diindolylmethane (DIM) in combination with TNFrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) on the prostate cancer cells. Methods CCK8 methods was used for detecting the survival rate of PC3 cells treated with DIM, TRAIL, or DIMTRAIL. The apoptosis rate of PC3 cells was tested by flow cytometry (FCM). The expression of caspase3 was measured by Western blot. Results Compared with that of control group, the proliferation of PC3 cells was inhibited and the apoptosis was induced differently in all treatment groups, and the expression of caspase3 was upregulated. The combined use of DIMTRAIL induced apoptosis of PC3 cells. Conclusions Combination use of DIM and TRAIL could obviously enhance the inhibitory effects and apoptosis rate on PC3 cells. The possible mechanism may be the upregulation of expression of caspase3.

　　【Key words】 Prostate cancer; TNFrelated apoptosisinducing ligand; 3, 3diindolylmethane; Apoptosis

　　前列腺癌是一种发生于老年男性的常见肿瘤。肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL)可诱导包括前列腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞凋亡，但研究报道至少50%的肿瘤细胞对TRAIL耐药〔1〕。3，3二吲哚基甲烷(3，3diindolylmethane，DIM)能消除自由基，激活凋亡信号通路，具有较强的抗氧化作用和促进多种肿瘤细胞凋亡作用〔2〕。因此，本文探索DIM协同TRAIL对前列腺癌细胞的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人前列腺癌细胞(PC3细胞)购自中国科学院。DIM、人重组TRAIL蛋白均购自美国Sigma公司;胎牛血清、RPMI1640培养液购自杭州四季青公司，胆囊收缩素/缩胆囊素8(CCK8)试剂盒购自日本同仁化学研究所，膜联蛋白V(Annexin V)凋亡试剂盒购自联科生物科技有限公司，兔抗人半脱氨酸蛋白酶(caspase)3多抗购自Santa Cruz公司，羊抗兔IgG二抗购自博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　人前列腺癌细胞PC3在10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃，5% CO2的培养箱中培养。

　　1.2.2 CCK8法测定PC3细胞增殖活性

　　取对数期生长的PC3细胞2×104/孔接种于96孔圆底培养板，每孔添加100 μl培养基，培养18 h后，分别加入化疗药物DIM(60 μl/L)、TRAIL(2.5 ng/ml)及DIM(60 μl/L)+ TRAIL(2.5 ng/ml)继续培养，每组设3个复孔，并设阴性对照组(不加化疗药物)。在培养24、48、72 h各时间点，分别加入10 μl/孔CCK8溶液，再经2 h培养后，酶标仪于450 nm处测其吸光度(A)值。

　　1.2.3 流式细胞仪检测PC3细胞凋亡率

　　取对数期生长的PC3细胞5×104/孔接种于12孔圆底培养板，每孔添加2 ml培养基，培养18 h后，分别加入DIM、TRAIL、DIM+TRAIL，浓度同前。于培养24、48、72 h各时间点，胰酶消化收集各组细胞，磷酸缓冲液(PBS)冲洗后用结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞数至1×106，取100 μl细胞悬液加入5 μl Annexin V异硫氰酸荧光素(FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)混匀后避光15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.2.4 caspase3表达测定

　　分组同上，细胞加药后24 h提取细胞总蛋白，取40 μg蛋白进行10%对钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝胶电泳，电泳结束后转移蛋白至 NC膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗3次;室温加入1∶200兔抗人caspase3多克隆抗体孵育2 h，TBST洗膜3次，加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶结合的羊抗兔 IgG/活化蛋白(AP)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，电化学发光(ECL)法显色。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析，数据以x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 DIM联合TRAIL对PC3细胞增殖活性的影响

　　TRAIL与DIM一样，作用后24、48、72 h对PC3细胞有一定杀伤作用，即细胞生存率明显减低(P<0.01)，而联合用药较单独用药的抑制作用更明显(P<0.01)，且TRAIL及TRAIL联合DIM的作用呈时间效应关系，72 h较48 h、48 h较24 h的抑制作用更大(P<0.01)，见表1。表1 DIM联合TRAIL对PC3细胞生存率的影响(略)

　　2.2 DIM联合TRAIL对PC3细胞凋亡的影响

　　在DIM、TRAIL分别作用下，PC3细胞凋亡率较对照组升高(P<0.01)，而联合用药较单独用药引起的凋亡更明显(P<0.01)，且凋亡呈时间依赖性，即72 h、48 h与24 h的凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。表2 DIM联合TRAIL对PC3细胞凋亡率的影响(略)

　　2.3 PC3细胞caspase3表达检测

　　可见在DIM、TRAIL分别作用下，PC3细胞表达caspase3量较对照组升高，而联合用药较单独用药引起的caspase3表达增加更明显。见图1。

　　3 讨 论

　　目前前列癌的治疗主要措施包括手术治疗和药物治疗。由于前列腺癌主要发生于老年男性患者，且易发生骨转移，因此手术治疗具有很大的局限性〔3〕。而前列腺癌经雄激素抑制药物治疗一段时间后，易转化为激素非依赖性肿瘤，雄激素抑制疗法就失去了治疗作用〔4〕。目前对激素非依赖性前列腺癌仍缺乏有效的药物治疗措施〔5〕。

　　TNF一直以来被认为是一种重要的潜在肿瘤化疗药物，TRAIL便是TNF超家族成员之一，它通过结合相应的死亡受体TRAILR1(DR4)和TRAILR2(DR5)活化凋亡机制〔6〕，选择性使癌细胞易于凋亡，而不损害正常细胞。本研究观察到小剂量TRAIL(2 ng/ml)对前列腺癌PC3细胞有一定抑制生长作用及诱导凋亡作用，且这种作用在给药后24 h发生，随时间延长而加强，72 h最显著。

　　DIM是吲哚3甲醇(I3C)的衍生物，研究表明I3C无论在体内还是体外，都表现出对多种肿瘤防治作用〔7〕。DIM能够较强地抑制蛋白激酶(Akt)信号传导途径，抑制Akt的蛋白水平及其磷酸化水平，进而下调雄激素受体水平和抑制其下游的周期调控因子(cyclin)D1、细胞周期依赖性激酶(CDK)4，6，诱导细胞凋亡〔8〕。有研究指出DIM对人激素非依赖性前列腺癌PC3细胞的生长具有抑制作用〔9〕。本研究观察到单独运用DIM处理PC3细胞能抑制其生长及诱导其凋亡，且呈时间依赖性，72 h后最强，与报道结果一致。

　　本研究中，当联合DIM与TRAIL处理PC3细胞时，PC3细胞的生长抑制率和凋亡诱导率较单独用药更明显，且在24、48和72 h时间点均高于单独用药，结果表明联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用加强。在DIM的协同做用下，TRAIL的抑制肿瘤作用明显增强，为探讨其机制，本文检测了caspase3的表达水平。caspase家族是细胞凋亡发生和调控机制中的重要因素，而caspase3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者〔10〕。基因敲除实验和动物模型也显示，抑制caspase3活性将显著阻滞体外和体内的细胞凋亡〔11〕。研究中发现给药组与对照组相比，各给药组caspase3表达上调，联合给药组表达量上调更明显，说明PC3细胞的凋亡抑制可能是caspase3上调所导致。

　　【参考文献】

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　　10 Kumar S.Caspase function in programmed cell death〔J〕.Cell Death Differ，2007;14(1):3243.

　　11 De Oca J，Azuara D，SanchezSantos R,et al.Caspase3 activity，response to chemotherapy and clinical outcome in patients with colon cancer〔J〕.Int J Colorectal Dis，2008;23(1):217.