溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中的作用

　　作者：徐伟1，郝林1 综述，韩从辉1*，杨建军2 审校 作者单位：(1.东南大学医学院附属徐州医院泌尿外科，江苏徐州221009;2.东南大学附属中大医院，江苏南京210009)

　　【摘要】 溶瘤腺病毒是继手术、放疗、化疗后治疗肿瘤的新式方法，它能特异性识别并感染肿瘤细胞，最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。目前溶瘤腺病毒Onxy-015(dl 152)已进入Ⅲ期临床试验，文章就溶瘤腺病毒治疗肿瘤的国内外研究进展进行综述。

　　【关键词】 溶瘤腺病毒;肿瘤

　　溶瘤病毒又称肿瘤增殖型病毒，是指能特异性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中大量复制最终裂解肿瘤细胞，释放出来以感染更多的肿瘤细胞的一类病毒，同时这些病毒因无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用[1]。早在一百年前，已有人发现某些肿瘤患者在感染病毒后出现自发性肿瘤缓解，受这一现象的启发，早在上个世纪初便有溶瘤病毒治疗的研究[2] 。20世纪90年代中期以来，随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤细胞的分子异常逐渐被人们揭示。同时，随着对常用病毒的基因结构以及对病毒与细胞、病毒与免疫系统相互作用分子机制认识的不断深入，使溶瘤病毒应用于肿瘤的临床治疗成为可能。

　　目前已研制成功并已在肿瘤临床研究中应用的主要有：腺病毒(adenovirus)、新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)、单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)等，其中腺病毒基因的结构及其表达调控研究得较为深入。将腺病毒改造成为溶瘤病毒最具代表性的是Onxy-015(dl 152)，它是最早被报道的溶瘤腺病毒，首先运用于肿瘤患者，现已成为进入Ⅲ期临床试验的溶瘤腺病毒。现就溶瘤腺病毒应用于肿瘤治疗的研究进展进行综述。

　　1 腺病毒的生物学特性

　　腺病毒在世界上普遍存在，约有100个血清型，其中能感染人类的至少有47个型别。腺病毒呈球形，无包膜，核衣壳为20面体立体对称，其病毒基因组为线形双链DNA，大小约为36 kb，可分为编码区和非编码区。编码区含有5个早期转录单位(E1A、E1B、E2、E3和E4)、2个延迟转录单位(Ⅸ和Iva2)和1个晚期转录单位(L1～L5)。根据基因的同源分A～F 6个亚组。不同腺病毒其亲嗜性有所不同，表现出特定的器官选择性[3]。例如，腺病毒D感染眼睛，而A型和F型作用于胃肠，C、E型以及一些B型腺病毒特异性地感染呼吸道。

　　在早期，大多数细胞处于静止期，病毒蛋白必须与宿主细胞蛋白作用才能激活细胞复制和分裂。E1A是病毒基因组中第一个转录的基因，其产物可以与诸如pRb、p107和p130蛋白家族的许多细胞蛋白结合。从而阻止细胞蛋白封闭E2F转录因子，启动DNA复制和细胞周期。腺病毒E1B基因表达产物阻止宿主细胞早期死亡，从而允许病毒无障碍复制。E1B-55kD蛋白与p53结合诱导其降解，而E1B-19kD蛋白的功能与抗凋亡因子Bcl-2相似，从而抑制感染细胞死亡，允许病毒复制。E2区编码与病毒DNA复制有关的蛋白质。 E3区编码多肽参与病毒宿主相互作用，可减弱感染细胞被机体免疫识别的概率[4]。E4区编码的蛋白质关闭宿主基因表达，使其有利于病毒繁殖，此外，可调节其他区的转录。主要的晚期转录区的转录在DNA复制之后，编码组成衣壳的蛋白质。一旦完成子代病毒装配，可以通过细胞溶解释放新的病毒颗粒。

　　2 溶瘤腺病毒的种类及应用

　　2.1 第1类溶瘤腺病毒 是将病毒复制所必需，而在肿瘤细胞中不需要的基因进行剔除，使病毒只能在肿瘤细胞中复制，该类溶瘤腺病毒主要包括Onyx-015和H101两种，能选择性杀Rb或p53细胞信号通路异常的肿瘤细胞。

　　2.1.1 Onyx-015(dl 152) 现称CI-1042,它由美国ONYX生化制药公司研制。正常细胞中具有p53肿瘤抑制蛋白，腺病毒E1B-55kD蛋白通过和p53肿瘤抑制蛋白结合使其失活，而使病毒复制继续进行。Onyx-015是腺病毒2型、5型的嵌合体，由于该病毒缺失E1B-55kD基因，不能形成功能性E1B-55kD蛋白，所以它只能在P53抑癌基因功能异常的细胞中复制。人类恶性肿瘤细胞大多p53异常，而正常组织细胞均表示高水平且功能正常的p53，因此Onyx-015能在肿瘤细胞中复制增殖，并最终导致其溶解死亡。目前该病毒已进入Ⅲ期临床试验，与放、化疗联合应用方能有效杀伤肿瘤细胞[5]。腺病毒E1A基因的产物是一种强有力的化学致敏剂，可在具有p53功能的细胞中诱发p53的高水平表达，并以此增加放化疗对DNA的损伤作用，但正常细胞不受E1A的影响。Dilley等[6]采用肿瘤内注入溶瘤腺病毒产品Onyx-015和5氟尿嘧啶(5-FU)，将其结果与单独注射Onyx-015或5-FU相比，受试对象为头部和颈部肿瘤患者，发现联合治疗的肿瘤消退效应增加了27%，且在6个月的观察中未见肿瘤进展。

　　但是单用Onyx-015疗效不佳，有效率低于20%。单用Onyx-015疗效不佳的原因在于它缺乏针对癌细胞的特异调控子以启动载体的自我复制。E1B-55kb缺失的腺病毒感染处于G1期的癌细胞，与处于S期的癌细胞相比，合成病毒晚期蛋白减少，繁殖后代少，细胞杀伤率低，Thomas等[7]认为这是由腺病毒E4区的开放阅读框1(E4orf1)所编码的病毒致癌基因所致，因此认为E4orf1限制了类似于Onyx-015的溶瘤腺病毒的溶瘤特性，而废除E4orf1功能则能提高其溶瘤疗效。Au等[8]对Onyx-015的肝功能影响进行了评估，35位结肠、直肠癌伴肝转移的患者接受8个疗程的2×1012病毒颗粒的肝动脉灌注，第1次疗程中，无患者有肝功能的改变，第2次疗程中，1位患者出现转氨酶的瞬间增高，第5次疗程中，出现2位患者胆红素瞬间增高;他认为反复进行肝动脉灌注Onyx-015而肝损害极小，是由于Onyx-015有肝细胞中的复制率低以及肝细胞间的柯萨齐-腺病毒受体(coxsackie-adenoviral receptor ，CAR)空间限制。

　　2.1.2 H101 又名安柯瑞，是利用基因工程技术对人类5型腺病毒进行基因重组得到的一种溶瘤病毒，由中国三维生物技术有限公司开发并拥有完全自主知识产权，获国家发明专利。H101删除了人5型腺病毒E1B-55kD区，可在p53基因突变的胰腺癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用;同时删除E3区78.3～85.8 mu基因片段，使肿瘤抗原信息能通过树突状细胞(DC)的传递而激活T细胞产生全身免疫，从而通过局部应用产生全身性的抗肿瘤效应。H101目前已经过鼻咽癌、头颈部及食管鳞癌等的Ⅰ～Ⅲ期临床试验并初步显示出其优良的抗肿瘤效应和安全性[9-10]，并已上市成为世界上首个正式进入临床应用的溶瘤病毒制剂。诸琦等[11]在体外研究中发现H101对人胰腺癌细胞系(BxPC-3)细胞株及BxPC-3荷瘤鼠动物模型的极大杀伤作用，并报道了首例EUS引导H101植入治疗晚期胰腺癌的尝试，应用计算机CT三维重建及灌注成像对治疗前后肿瘤体积及血流灌注特征的改变进行疗效分析。初步结果显示，治疗后肿瘤体积缩小、瘤体明显液化坏死、血液供应减少。

　　2.2 第2类溶瘤腺病毒 是将肿瘤特异性启动子放置于腺病毒某些必需基因(目前主要是E1A)前面驱动这些基因的转录翻译，使腺病毒仅能在肿瘤细胞中复制起到特异性溶瘤效果。

　　2.2.1 前列腺癌特异性抗原(PSA) 其血清水平增高与前列腺癌的分级和分期有关，是预后的关键指标。Rodriguez等[12]构建了溶瘤腺病毒CV706(又称CN706、CG7060)，它是由PSA启动子调控腺病毒E1A基因的表达，同时删除腺病毒E3区。CV706在PSA高表达的细胞系中，E1A基因水平和病毒滴度明显增高，而对不表达PSA的细胞系没有影响;另外，Rodriguez对20位复发的前列腺癌用1×1011～1×1012的CV706病毒颗粒进行治疗，发现CV706能使研究对象的血清PSA水平下降，且不会引起任何不可逆的3级或4级毒性反应。

　　溶瘤腺病毒CV787保留了E3区，插入了鼠的腺血管舒缓素启动子(probasin)以调控Ad5E1A基因，同时插入PSA启动子和增强子以调控Ad5E1B的表达。用CV787对荷瘤小鼠进行尾静脉注射，发现CV787抗肿瘤效应明显增强。CV787与CV706相比对前列腺癌杀伤力以及特异性均有明显提高。更重要的是CV787还可以杀伤远处转移的前列腺癌细胞。最近的Ⅰ期临床试验证实，应用CV787临床上是安全的，在23位用CV787治疗的激素依赖型的转移性前列腺癌患者中，有5位患者血清PSA水平下降了25%～49%[13]。

　　2.2.2 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT) hTERT是端粒酶复合物的核心成分，维持细胞端粒的长度，其表达状态与端粒酶活性显著相关，是细胞调控端粒酶活性的关键环节。hTERT 基因的表达主要是从转录水平上调节，在90%左右的肿瘤细胞中转录上调，而在静息期细胞中不转录。因此，hTERT启动子被多个实验室相继克隆出来，并且用来控制外源基因的表达，提高肿瘤基因治疗的靶向性。有研究显示，hTERT在92.0%的膀胱癌细胞中高效表达,而在正常细胞中几乎无表达[14]。由此可以推知，hTERT启动子是一个广泛的肿瘤特异性启动子，能够使外源基因的表达限制在肿瘤细胞中。CNHK300腺病毒增殖必需基因E1A由hTERT启动子调控。李月敏等[15]在研究中发现CNHK300在感染HER-2高表达的乳腺癌细胞株(SKBR-3)48 h后，病毒增殖倍数为20 000倍，远强于对照组野生型腺病毒wtAd5，有复制能力;但在感染正常成纤维细胞(MRC-5)48 h后，CNHK300与wtAd5复制倍数分别为63倍和4 848倍，统计学显示有显著性差异。由此可见CNHK300能选择性地在端粒酶阳性肿瘤细胞内表达，从而调控腺病毒的选择性复制和杀伤肿瘤细胞。

　　除了上述2种肿瘤特异性启动子外，还有AFP启动子、CEA启动子、存活素启动子、黏蛋白1(DF3/Mucl)启动子等通过调控腺病毒早期复制必需基因，均在研究中取得不错的抗肿瘤效果，其应用前景令人期待。不过使用肿瘤特异性启动子调节腺病毒复制的主要局限是它们不是在所有肿瘤类型中都有活性。即使在一种肿瘤中，不可能所有的细胞都表达一种特异性肿瘤标志物，因为大多数肿瘤是异质的，这给其余的非表达细胞选择的优势。

　　2.3 对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰，达到特异性结合肿瘤细胞的目的 腺病毒进入体细胞首先是其表面蛋白与细胞表面特异的受体结合，2型和5型腺病毒对细胞的感染是由纤毛上的结区与其受体柯萨奇-腺病毒受体(CAR)结合而介导的，它们对组织的感染主要取决于CAR的表达水平。在人体中，CAR广泛表达于各种上皮组织。但是，据报道CAR在许多肿瘤组织中存在不同程度的下调或缺失[16]。因此，构建特异性识别肿瘤细胞表面受体的新配体的外壳基因能增强溶瘤腺病毒与肿瘤细胞的结合，CD46被证明是人B型腺病毒的高亲和力受体[17]。Ranki等[18]构建了一种新型的依赖p16通道的溶瘤腺病毒Ad5.pK7-Δ24，它在纤毛蛋白C端多聚赖氨酸的存在下，其亲和力趋向乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。

　　AdΔ24是腺病毒E1A第2恒定区24bp缺失的肿瘤特异性增殖的腺病毒，能直接吸附至细胞表面的αvβ3和αvβ5整联蛋白上。它不能有效结合RB蛋白以释放E2F，而E2F能有效诱导病毒在静止期细胞中的增殖，而癌细胞普遍缺乏RB蛋白，故而有大量E2F的存在，导致病毒增殖而杀伤细胞[19]。Guse等[20]在小鼠肾癌细胞皮下模型中，用Ad5/3-Δ24、Ad5-Δ24RGD、Ad5.pK7-Δ24以及对照组野生型腺病毒进行瘤内注射，结果显示经Ad5/3-Δ24、Ad5-Δ24RGD、Ad5.pK7-Δ24治疗的肿瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积(所有P值均小于0.001)。

　　3 结 语

　　迄今为止，绝大多数研究均提示溶瘤腺病毒具有确切的肿瘤杀伤作用，而且毒副反应小。随着肿瘤分子生物学、分子免疫学及相关学科的不断发展，溶瘤腺病毒必将更为成熟，逐步成为继手术、放疗、化疗之后治疗肿瘤的有力新式武器，而其发展对于我们来说仍将是任重而道远的任务，相信溶瘤腺病毒治疗肿瘤在不远的将来得到广泛的临床应用。

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