HIF-1α与CAⅨ在肾细胞癌中的表达及临床意义

　　作者：彭启宇，温儒民，薛松 作者单位：徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与碳酸酐酶9(CAⅨ)在肾细胞癌中的表达及相互关系。方法 采用免疫组织化学P-V方法检测54例肾癌石蜡标本切片中HIF-1α和CAⅨ的表达，并探讨其与临床病理因素之间的关系。结果 HIF-1α在肾癌组织中表达阳性率为55.6%(30/54)，其表达与不同临床分期、病理分级有关(P<0.05) ,与组织学类型无关(P>0.05);CAⅨ在肾癌组织中表达阳性率为68.5%(37/54)，其表达与不同临床分期、病理分级及组织学类型无关(P>0.05);HIF-1α和CAⅨ在肾癌组织中的表达呈正相关(r=0.437，P=0.001)。结论 肾癌中HIF-1α和CAⅨ的高表达和高相关性提示了以缺氧诱导因子通路为基础的分子靶向治疗的可行性。

　　【关键词】 肾细胞癌;缺氧诱导因子-1α;碳酸酐酶9

　　The overexpression and clinical significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and carbonic anhydrase Ⅸ in renal cell carcinoma

　　PENG Qiyu, WEN Rumin, XUE Song

　　Department of Urology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou， Jiangsu 221002， China

　　Abstract: Objective To investigate the expression of HIF-1α and CAⅨ in renal cell carcinoma (RCC) and to evaluate their significance. Methods The expressions of HIF-1α and CAⅨ were tested by immunohistochemistry in 54 specimens of RCC tissue, with the results analyzed by relating them to the clinical stage and pathological grade. Results The HIF-1α expression in RCC tissue was 55.6%, not related to the histological type (P>0.05), but related to the clinical stage and pathological grade of RCC (P<0.05) . The CAⅨ expression in RCC tissue was 68.5% positive, not related to the histological type, pathological grade or clinical stage of RCC (P>0.05). The expression of HIF-1α was positively correlated with the expression of CAⅨ (r=0.437, P=0.001). Conclusion The overexpression and high correlation of HIF-1α and CAⅨ in renal cell carcinoma support the feasibility of using targeted molecular therapy to treat RCC.

　　Key words: renal cell carcinoma (RCC); hypoxia-inducible factor-1 alpha; carbonic anhydrase Ⅸ

　　肾细胞癌(RCC)在成人泌尿生殖系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌居第二位，且对放化疗、生物治疗不敏感，预后较差。肾癌的发生机制复杂，约60%的肾癌患者存在抑癌基因——希佩尔-林道基因(VHL)的突变[1]，当VHL突变或失活后，VHL蛋白缺乏，在氧含量正常的情况下，也无法降解缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，使HIF-1α聚集导致下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)、碳酸酐酶9(CAⅨ)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)、促红细胞生成素(EPO)等基因表达，激活多激酶信号通路，导致肿瘤细胞增殖、能量代谢失调、血管生成及侵袭和转移。本实验采用免疫组织化学方法检测HIF-1α及下游靶基因产物CAⅨ在肾癌组织中的表达，探讨其相关性及其与临床病理因素之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源

　　收集2004年1月—2006年6月徐州医学院附属医院手术切除的肾癌石蜡包埋组织块54例，行苏木精-伊红染色确认符合诊断的标本行免疫组织化学研究。肾癌组织标本中：患者男性31例，女性23例，年龄18～73岁，平均(53±12.5)岁;其中透明细胞癌41例，乳头状细胞癌9例，其他类型4例;按1997 WHO病理分级，G1为17例，G2为23例，G3-G4为14例;按TNM分期(2002 AJCC)，Ⅰ期20例，Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期11例。12例经病理证实的正常肾组织设为正常对照。

　　1.2 主要试剂

　　浓缩型一抗HIF-1α鼠抗人单克隆抗体、通用型P-V试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品，浓缩型一抗CAⅨ兔抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。

　　1.3 实验方法

　　全部标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，免疫组化方法采用P-V二步法。石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗， PBS 浸泡5 min，1 mmol/L乙二胺四乙酸(pH 8.0)抗原修复液行直接高压热修复并迅速冷却，分别滴加稀释的一抗(HIF-1α 1∶20，CAⅨ 1∶100)，4℃冰箱过夜。次日37℃复温25 min，PBS冲冼，滴加二抗辅助液，室温或37℃孵育20 min，PBS冲洗，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗。DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照，已知乳腺癌阳性切片作阳性对照。

　　1.4 免疫组化结果判定

　　HIF-1α阳性表达定位于细胞核，极少表达于细胞质;CAⅨ阳性表达定位于细胞质，少量表达于细胞核及细胞膜。在400倍光镜下随机观察10个视野,每个视野计数100个细胞，观察阳性细胞个数并计算其平均数。HIF-1α阳性标准:阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数≤10%;阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数>10%。CAⅨ阳性标准: 阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数≤10%;阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数>10%。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS 13.0软件进行数据处理;采用Fisher 确切概率法分析HIF-1α、CAⅨ在肾癌的表达与病理分级、组织学类型及临床分期之间的统计学意义，采用Spearman 等级相关方法分析HIF-1α和CAⅨ在肾癌的表达相关性;检验水准：α= 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 HIF-1α蛋白在肾癌组织中的表达

　　HIF-1α在54例肾癌组织中的阳性表达率为55.6%(30/54);不同病理分级间HIF-1α阳性率有差别(P=0.015)，不同临床分期间HIF-1α阳性率有差别(P=0.04)，HIF-1α阳性表达率与肿瘤组织学类型无关(P=0.894)。见表1、图1。

　　2.2 CAⅨ蛋白在肾癌组织中的表达

　　CAⅨ蛋白在54例肾癌组织中的阳性表达率为68.5%(37/54)，其表达与肾癌的临床分期、病理分级及组织学类型无关(P>0.05)。见表1、图2。 表1 肾癌组织HIF-1α及CAⅨ的表达及其与组织学类型、病理分级及临床分期的关系(略)

　　2.3 肾癌组织中HIF-1α与CAⅨ蛋白表达的关系

　　54例肾癌组织中，有26例HIF-1α蛋白与CA Ⅸ蛋白同时表达阳性，13例两者同时表达阴性。HIF-1α蛋白与CA Ⅸ蛋白在肾癌组织中表达中呈正相关关系(r=0.437,P=0.001)，见表2。表2 HIF-1α与CA Ⅸ蛋白表达的相关性(略)

　　3 讨 论

　　HIF-1α介导转录的基因如VEGF、CAⅨ、EPO、GLUT-1等[2]涉及血管新生、调节细胞内外微环境、铁与血红蛋白的代谢及能量代谢和NO的合成等，在肿瘤适应缺氧的过程中起着关键性的调控作用[3]，并在促进肿瘤的恶性转化、肿瘤的生长浸润和扩散以及对放疗及化疗抵抗中起着重要作用[4]。Zhong等[5]对包括结肠癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等19种恶性肿瘤进行研究，其中有13种癌组织出现HIF-1α过表达，大多数正常组织不表达或仅有少量表达。本实验发现，HIF-1α在正常肾组织无阳性表达，而在54例肾癌组织中阳性表达率55.6%，提示多数肾癌组织缺氧导致HIF-1α过表达，激活多种靶基因的转录，使之适应缺氧环境。

　　CAⅨ 是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，CAⅨ 能够催化CO2水化生成H+和HCO-3，HCO-3与细胞内Cl-交换,维持细胞内碱性环境，有利于细胞的生长;细胞内H+则通过离子泵、H+-Na+交换等方式运输到细胞外,使细胞外为酸性微环境，细胞外酸性环境可以激活细胞表面蛋白，在调控细胞增殖、转化方面有重要作用，并有利于肿瘤的生长和转移[6]。CAⅨ 位于VHL肿瘤抑制基因的下游，由HIF-1途径激活,在正常组织中表达极低,在肾细胞癌中高度表达。本实验显示，CAⅨ 肾癌表达率为68.5%(37/54)，与肿瘤的病理细胞类型、病理分级、临床分期无明显相关性。

　　本组结果显示，HIF-1α与CAⅨ在肾癌组织中表达呈正相关关系(r=0.437，P=0.001)。HIF-1α与CAⅨ 在正常组织中表达极低，在肾细胞癌中高表达，且肾癌对放化疗不敏感，免疫治疗有效率<30%[7]，提示HIF-1α与CAⅨ 可能成为判断肾癌转移与预后等生物学行为的重要参考指标并成为抗肿瘤治疗的新靶点。通过针对HIF-1α的治疗，抑制下游靶基因的表达，直接影响肿瘤的能量代谢及血管生成，有望取得满意的临床疗效。

　　【参考文献】

　　[1]Wiesener MS, Münchenhagen PM, Berger I, et al. Constitutive activation of hypoxia-inducible genes related to overexpression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in clear cell renal carcinoma [J]. Cancer Res, 2001,61(13):5215-5222.

　　[2]Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy [J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(10):721-732.

　　[3]Kuijper A, van der Groep P, van der Wall E, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and its downstream targets in fibroepithelial tumors of the breast [J]. Breast Cancer Res, 2005,7(5):R808-R818.

　　[4]Bachtiary B, Schindl M, Ptter R, et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor-1 alpha indicates diminished response to radiotherapy and unfavorable prognosis in patients receiving radical radiotherapy for cervical cancer [J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(6): 2234 -2240.

　　[5]Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in common human cancers and their metastases [J]. Cancer Res, 1999,59(22):5830-5835.

　　[6]Ivanov S, Liao SY, Ivanova A, et al. Expression of hypoxia inducible cell-surface transmembrane carbonic anhydrases in human cancer [J]. Am J Pathol, 2001,158(3): 905-919.

　　[7]Costa LJ, Drabkin HA. Renal cell carcinoma: new developments in molecular biology and potential for targeted therapies [J]. Oncologist, 2007,12(12):1404-1415.