外周血EGFR mRNA在膀胱癌中的表达及在微转移中的意义

　　作者：李应龙　石家齐　陈方敏 作者单位：(1.贵州省人民医院 放射介入科， 贵州 贵阳 550002; 2.贵阳医学院附院 泌尿外科, 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 探讨表皮生长因子受体( Epidermal growth factor receptor，EGFR) mRNA在膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma, TCC)患者外周血中的表达及意义。 方法: 收集62例膀胱移行细胞癌患者外周静脉血及癌组织标本，提取总RNA，行RTPCR，检测EGFR mRNA的表达。25例健康人外周静脉血标本作为对照。结果: 62例膀胱TCC组织标本中, EGFR mRNA在组织中平均阳性率72.6 % (45/62)。在Tis1、T2、T3、T4期膀胱TCC患者组织中EGFR mRNA阳性率分别为57.1%、62.5%、85.7%、100 %;在Tis1、T2、T3、T4期膀胱TCC患者外周血中EGFR mRNA阳性率分别为14.3%、25.0%、78.6%、90.9%。在组织和外周血中低分期(Tis1、T2)与高分期(T3、T4)膀胱TCC表达EGFR mRNA阳性率差异有显著性(P<0.01)。在25例健康人外周静脉血中均未发现EGFR mRNA的表达。结论: 膀胱TCC组织及外周血中EGFR mRNA表达阳性率与肿瘤分期、是否转移呈相关性。RTPCR法检测膀胱TCC患者外周血EGFR mRNA有望成为检测膀胱肿瘤细胞循环内微转移的有效方法。

　　【关键词】 膀胱肿瘤; 逆转录聚合酶链式反应; 受体，表皮生长因子; 膀胱移行细胞癌; 微转移

　　Expression of Epidermal Growth Factor Receptor mRNA of Peripheral

　　Blood in the Bladder Transitional Cell Carcinoma and Its Micrometastasis

　　LI Yinglong，SHI Jiaqi，CHEN Fangmin

　　(1.Department of Interventional Radiology, Guizhou Province People's Hospital, Guiyang 550002, Guizhou, China;

　　2.Department of Urology,The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550000, Guizhou,China)

　　[Abstract] Objective: To explore the expression of epidermal growth factor receptor ( EGFR) mRNA in peripheral blood of patients with bladder transitional cell cancer(TCC) and its significance. Methods: Peripheral vein blood and tumor tissue samples of 62 patients with bladder TCC (group TCC) were collected and peripheral blood of 25 healthy subjects were collected as negative control (group C). The expression of EGFR mRNA was detected by RTPCR. Results: The positive rates of EGFR mRNA expression averaged 72.6%(45/62) including 57.1%,62.5%，85.7%，and 100 % in tissue samples and 14.3%,25.0%,78.6%, and 90.9% in peripheral blood samples from group TCC of stages of Tis1,T2,T3, and T4 respectively. There was a significant difference of EGFR mRNA expression in tissue and blood samples of TCC between stages Tis1,T2 and stages T3, T4 (P<0.01) . EGFR mRNA was not detected in the 25 healthy people. Conclusion: Positive rates of EGFR mRNA expression in samples of tissue and peripheral blood were correlated with the staging and grading, and metastasis of TCC. RTPCR might be one of the effective methods for detecting micrometastasis in circulating of bladder tumor cells.

　　[Key words] bladder neoplasms; reverse transcriptase polymerase chain reaction; receptor,epidermal growth factor; transitional cell of the bladder; micrometastasis

　　膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤[1]，膀胱癌的浸润、转移是其复发和影响其预后的重要因素。血行转移是膀胱癌主要转移途径之一，若能早期发现膀胱癌患者外周血中是否有癌细胞及其微转移倾向对于选择适宜的治疗和准确的预后判断具有十分重要的意义[2]。应用RTPCR检测膀胱移行细胞癌患者组织及外周血表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR) mRNA，探讨检测外周血EGFR mRNA作为膀胱癌细胞血液微转移标志的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　收集贵阳医学院附属医院泌尿外科2006年3月～2008年3月62例膀胱癌住院患者,均经病理证实为移行细胞癌。其中男38例,女24例,年龄33～88岁,平均65.9岁。健康志愿者25例,男15例,女10例,年龄27～65岁,平均46.5岁，作为对照组。62例膀胱TCC患者按国际抗癌联盟(UICC)标准进行分期,其中Tis、T1、T2、T3、T4期分别为7、14、16、14、11例。

　　1.2 试剂与仪器

　　人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;TRNzolA+总RNA提取试剂，2倍Taq PCR MasterMix(含染料)均购自天根生化科技(北京)有限公司;cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas International 公司。梯度PCR 扩增仪为德国Eppendorf公司产品。EGFR的引物参照文献[3]设计,上游引物: 5’CTTCTTGCAGCGATACAGCTC 3’;下游引物: 5’ATGCTCCAATAAATTCACTGC 3’，扩增片段长度为441 bp。基因βactin的cDNA片段作为内参照,验证反转录和聚合酶链反应的完整性,上游引物: 5’TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTC 3’;下游引物: 5’GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA 3’，扩增片段大小共168 bp。引物及βactin内参照均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.3 方法

　　采集患者术前静脉血液标本3～5 ml,置入EDTA管抗凝。采样后1 h内快速处理, 人淋巴细胞分离液分离有核细胞 ,加入1 ml TRNzolA加试剂溶解,放入-70 ℃ 冰箱保存备测。同法采取健康志愿者外周血3～5 ml ,作以上相同处理。将术中切除的肿瘤标本取少许(约1 g)，1 h内置入液氮内保存备测。所有血液标本及病理组织用人淋巴细胞组织液处理后，经TRNzolA+试剂按常规提取总RNA，经过氯仿分层，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，提取出总RNA。总RNA提取后,用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度,计算样品总RNA浓度。逆转录合成cDNA：取提取的总RNA 2 μl，根据逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系总体积为20 μl。反应条件：1 g/L模板总RNA 2 μl，0.5 g/L Oligo(dT)18 1 μl，RNasefree ddH2O 9 μl，共12 μl在70 ℃水浴5 min后，冰浴30 s，再于试管内加入5倍Reaction Buffer 4 μl，20 U/μl RNase Inhibitor 1 μl，10 mmol/L dNTP Mix 2 μl，反应混合物于37 ℃水浴5 min，最后加入1 μl MMuLV RT(200 U/μl)，终体积为20 μl，于42 ℃水浴60 min，70 ℃ 加热10 min结束反应，-20 ℃冷冻保存。PCR扩增：取第一链cDNA 2.0 μl按PCR试剂盒组建反应，反应体系总体积25 μl。第一链cDNA 2.0 μl，10 μmol上游引物1.0 μl，10 μmol下游引物1.0 μl，2倍PCR Master Mix 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应条件：内参βactin循环条件：94 ℃ 3 min预变性， 94 ℃ 45 s变性，55 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸30 cycles，最后72 ℃延伸7 min;EGFR循环条件:94 ℃ 3 min 预变性， 94 ℃ 30 s变性，57.2 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸 30 cycles，最后72 ℃ 延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下照相。观察到168 bp 产物带则证明逆转录模板有效,同时441 bp处出现产物带图像则判定EGFR表达阳性。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS 11.5版统计软件包行χ2检验， P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 组织中EGFR mRNA的表达情况

　　62例膀胱移行细胞癌患者组织标本中,EGFR基因阳性表达为45例 (45/62, 72.6%),21例Tis1期12例表达,16例T2期10例表达, Tis1～T2期膀胱TCC患者共37例有22例组织表达(22/37,59.5%),T3、T4期共25例有23例表达(23/25, 92.0%),其中T4期11例转移者均表达。 经SPSS11.5统计软件分析,膀胱TCC患者组织中Tis1、T2 组中EGFR阳性率表达差异无显著性(χ2=0.108,P=0.742);T3、T4组中EGFR表达阳性率差异无显著性;膀胱TCC患者组织中Tis1加T2与T3加T4期EGFR表达阳性率差异有显著性(χ2=7.938,P<0.01)。见表1　表1 EGFR mRNA在组织中的表达

　　2.2 外周静脉血中EGFR mRNA的表达情况

　　62例膀胱移行细胞癌患者血液标本中,EGFR基因阳性表达为28例 (28/62, 45.2%),21例Tis1期3例表达,16例T2期4例表达, Tis1、T2膀胱TCC患者外周血标本共7例表达(7/37,18.9%),T3、T4期共25例有21例表达(21/25,84.0%)。所有外周血中检测到EGFR mRNA阳性的病例，相应的原发肿瘤病灶中EGFR mRNA表达均为阳性。25例健康献血者外周血未见阳性表达。经SPSS 11.5统计软件分析,膀胱TCC患者外周血中Tis1、T2 组中EGFR表达阳性率差异无显著性(χ2=0.680,P=0.410);T3、T4组中EGFR表达阳性率差异无显著性;膀胱TCC患者外周血中Tis1加T2与T3加T4期EGFR表达阳性率差异有显著性(χ2=25.516,P<0.01)。62例膀胱移行细胞癌患者血液标本与健康献血者相比，EGFR表达阳性率差异有显著性(P<0.01)。见表2。膀胱TCC患者血标本中EGFR的PCR电泳结果见图1。表2 EGFR mRNA在外周血中的表达

　　3 讨论

　　微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，直径≤2 mm, 常无任何临床表现，常规方法如CT、MRI、普通病理检查等都很难发现。微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可以直接侵

　　图1 TCC 患者外周血中EGFR mRNA的表达

　　Fig.1 Expression of EGFR mRNA in peripheral blood of TCC patients 袭周围组织或种植于体腔。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。但动物实验表明，有0.01%的循环肿瘤细胞能到达下一器官并发展成显性转移, 微转移是肿瘤转移、复发的基础和前提, 微转移的检测有利于判断预后、指导治疗[3]。由于血浆中富含大量的RNA酶,一旦血浆中出现RNA即会被降解,故血浆中不会有游离的mRNA,因此通过RTPCR技术检测到的mRNA显然来自外周血中完整的循环细胞,选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素[4]。

　　表皮生长因子受体(EGFR)为分子量170 kD的糖蛋白，存在于哺乳动物除血细胞以外的所有细胞中,EGFR过度表达参与上皮源性恶性肿瘤的发生和发展[5]。多项研究证实EGFR的高表达在细胞恶性转化和恶性增殖中起着重要作用[6]。

　　本实验利用RTPCR技术采用EGFR基因检测膀胱TCC患者循环肿瘤细胞。结果显示: 62例患者外周血检测出28例EGFR mRNA阳性，占45.2%(28/62)，而25例健康人无一例检测到阳性,二者比较，EGFR表达阳性率差异有显著性(P<0.01)，提示EGFR mRNA作为循环膀胱癌细胞的标志具有可行性和特异性。

　　检测膀胱癌患者组织与外周血发现，Tis1加T2与T3加T4期EGFR mRNA表达阳性率差异有显著性(P<0.01)。提示膀胱TCC患者组织及外周血中EGFR阳性表达与肿瘤临床分期呈正相关，随着肿瘤临床分期的进展，EGFR阳性表达率也越高。

　　Neal[7]等用免疫组织化学技术对101例膀胱癌标本进行研究,EGFR阳性表达率为48%，并随访30个月,发现EGFR强阳性表达与临床分期呈正相关(P<0.001);多变量分析表明, EGFR表达与膀胱肿瘤的进展、病理分级、多灶性及复发性呈正相关,认为EGFR可作为判断膀胱癌预后的重要因子。叶章群[8]等也用免疫组织化学技术检测52例膀胱癌发现：EGFR阳性表达率为65.4%，与膀胱癌的病理分级、临床分期和患者预后有关。本实验结果显示膀胱癌患者外周血EGFR mRNA的表达与肿瘤侵袭和转移间有明显相关性，与上述报道基本一致。

　　另外本研究结果显示，Tis1期的膀胱肿瘤患者外周血中也检测出EGFR mRNA，表明外周血中己存在膀胱肿瘤细胞，早期的肿瘤亦存在癌细胞的血行播散。虽然血液中存在癌细胞并不意味一定就会发生转移瘤，但肿瘤细胞进入血液是肿瘤发生远处转移的必要条件。由于自身机体免疫系统的作用，微转移的癌细胞处于休眠状态，随着病情发展，当癌细胞突破机体自身防御屏障时转移灶即形成[9]。对外周血EGFR表达阳性的膀胱癌患者进行密切随访，对转移灶及早发现、及早治疗、改善患者预后有重要意义。因此, RTPCR检测外周血EGFR mRNA为临床常规检测膀胱TCC微转移、预后评价等均提供了可行性,值得进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]顾方六,刘玉立.50年泌尿男生殖系肿瘤发病和构成情况的变迁[J].中华泌尿外科杂志,2002(23):88-90.

　　[2]Mocellin S, Keilholz U, Rossi CR, et al.Circulating tumor cells: the leukemic phase of solid cancers [J].Trends Mol Med, 2006 (3): 130-139.

　　[3]Gazzaniga P,GandiniO,GiulianiL,et al.Detection of epidermal growth factor receptor mRNA in peripheral blood:a new marker of circulating neoplastic cells in bladder cancer patients [J]. Clin Cancer Res,2001(7):577-583.

　　[4]陈兵,王云海.胃癌患者外周血肿瘤细胞的检测及其临床意义[J].中华医学实践杂志, 2004(6)：509-511.

　　[5]Mitsuhashi A,Tanaka N,Suzuka K,et al.Detection of epidermal growth factor receptor mRNA in peripheral blood of cervical cancer patients [J].Gynecol Oncol, 2003(89):480-485.

　　[6]朱安义，史子敏.表皮生长因子受体在膀胱癌非肿瘤黏膜中的表达及意义[J].中华泌尿外科杂志，2006(27)：43-45.

　　[7]Neal DE, Sharp les L,Smith K,et al. The epidermal growth factor receptor and the prognosis of bladder cancer[J].Cancer April, 1990(65):1619-1625.

　　[8]严泽军，叶章群.LRIG1和EGFR在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义[J].临床泌尿外科杂志，2007(3):216-218.

　　[9]王敬萍，郑华，李宝兰，等.EGFR基因突变与肺癌EGFRTK1获得性耐药的研究进展[J].实用临床医药杂志，2008(09)：5.