糖尿病大鼠膀胱超微结构改变及毒蕈碱受体基因表达的研究

　　作者：黄启敏，李宏，黄达飞，周青英 作者单位：平阳县人民医院 泌尿外科，浙江 温州 325400

　　【摘要】目的：研究病程3周的2型糖尿病(DM)大鼠膀胱超微结构改变以及毒蕈碱型受体基因表达改变。方法 ：2日龄雌性Wistar大鼠随机分成2型糖尿病组和正常对照组，链脲佐菌素按 90 mg/kg体重腹腔注射并结合高糖高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型。于糖尿病病程第4周时观察糖尿病大鼠膀胱超微结构改变;并以RT-PCR法检测毒蕈碱型受体mRNA表达水平。结果 ：病程第4周时糖尿病大鼠膀胱肌层电镜下有明显的肌细胞核固缩、细胞器空洞样变、细胞连接纤维化、成纤维细胞变性及胶原纤维排列紊乱。糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌毒蕈碱型受体mRNA的数量显著高于正常对照组，为(58.0±6.2)% vs (34.8±9.8)%，P<0.05。结论：本研究证实了糖尿病大鼠膀胱超微结构及毒蕈碱型受体表达的改变，为预防、治疗DM所致膀胱病理改变，解决糖尿病性神经源性膀胱提供科学依据。

　　【关键词】 糖尿病 2型 受体 毒蕈碱 超微结构

　　由糖尿病(diadetes mellius，DM)引发的自主神经病变而所致的神经源性膀胱是泌尿外科临床上最为棘手的难题之一。与排尿生理活动密切有关的两个因素是膀胱尿道的肌肉与其支配的神经系统，以往的研究主要集中在原发的病理改变与水平(即神经系统病变的定性与定位)方面，而对排尿障碍时受累终末器官——膀胱的功能缺陷研究不多。

　　有学者在研究链脲佐菌素(STZ) 诱导的大鼠DM对于排尿功能的急性影响时发现，排尿功能障碍是逐渐出现的。所以，本实验选取病程3周的2型DM大鼠作为研究对象，深入研究糖尿病性膀胱超微结构改变以及毒蕈碱型受体(Muscarinic receptor，M受体)基因表达改变，为预防、治疗DM所致膀胱病理改变，解决DM性神经源性膀胱这一临床难题提供科学依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物模型与分组 新生雌性Wistar大鼠2日龄30只，体重10～15 g，购自山东大学动物实验中心，合格证号：SCXK(鲁)0030004，随机分成正常对照组和DM组，每组15只。DM大鼠：STZ溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=7.4) 配成200 g/L溶液，按90 mg/kg体重剂量腹腔注射1次，待4周龄断乳时再以200 g/L STZ 25～30 mg/kg体重腹腔注射追加1次，并以高糖高脂饮食(18%猪油，20%蔗糖，3%蛋黄粉，59%基本饲料)饲喂。8周龄时以空腹尾静脉血糖浓度>11.1 mmol/L为造模成功。正常对照组：注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。两组均自由进食进水。于DM病程第4周时进行实验。

　　1.2 离体全膀胱制备 腹腔注射戊巴比妥30 mg/kg 体重，麻醉后以仰卧位固定大鼠，取下腹正中切口暴露膀胱，切除膀胱称湿重[1]。切取膀胱体部立即置于液氮保存。切取膀胱全层组织，以10%甲醛固定，浸蜡，包埋切片，予常规苏木精-伊红染色，于40～400倍光镜下观察，测定膀胱壁厚度。取大鼠膀胱肌肉组织，取1 mm×1 mm×1 mm置于4%戊二醛溶液低温固定，包埋、切片、锇酸染色定位后超微切片，于1～1.5万倍透射电镜下观察。

　　1.3 RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平 按照说明书方法(上海生工产品)提取总RNA，取100 mg组织剪碎后加入80μL Trizol试剂，-20 ℃过夜。加200μL氯仿剧烈振荡混匀，12 000 r/min室温离心5 min，取上清。加等体积异丙醇，12 000 r/ min 室温离心5 min，取沉淀即为细胞总RNA。以70%酒精精洗涤2次，12 000 r/min室温离心2 min，RNA沉淀于室温下自然干燥，使酒精完全挥发。分光光度法测定RNA纯度及浓度后，取2μg应用MMLV第一链cDNA 合成试剂盒(上海生工产品) 进行逆转录反应合成第一链cDNA。取总RNA模板2μg、引物Oligo(dT) 18(0.5 g/L)1μL，用Rnase-free ddH2O定容至12μL，混匀，70 ℃水浴5 min。加入5×Reaction Buffer 4μL、RNase Inhibitor(20 kU/L) 1μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL混匀，37 ℃水浴5 min。加入1μL M-MuLV RT(20 kU/L)，终体积为20μL。37 ℃水浴60 min，70 ℃加热10 min 结束反应，-20 ℃冻存。应用Primer 3.0软件进行引物设计。选用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。按照高保真即用聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(上海生工产品)说明书进行PCR扩增反应。反应体系为：2 ×HiFi-PCR Master 2.5μL、Sterial ddH2O 8μL、12.5μmol/L 引物各1μL、10μg/L 第一链cDNA 2.5μL，总体积为25μL。反应条件为：94 ℃，5 min;94 ℃，40 s;60 ℃，40 s;72 ℃，40s (40 个循环);72 ℃，10 min。PCR 扩增产物在1.6%的琼脂糖凝胶中100 V恒压电泳约30 min 后，用复日FR-980生物凝胶电泳图像分析系统对电泳带成像并进行图像分析，测定其灰度值并计算M3受体与GAPDH标准的mRNA 浓度比值用于定量比较。

　　1.4 统计学处理方法 采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 DM大鼠膀胱病理改变 DM大鼠均建模成功。相对于正常大鼠，DM大鼠膀胱壁结构光镜下可见肌细胞肥大，形态多样，肌纤维排列紊乱，间质纤维组织及胶原增生，黏膜下层有明显嗜酸性粒细胞浸润，肌层有轻度黏液样变性;膀胱肌层电镜下有明显的肌细胞核固缩、细胞器空洞样变、细胞连接纤维化、成纤维细胞变性及胶原纤维排列紊乱。

　　2.2 RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平 病程4周时DM组大鼠膀胱逼尿肌M3受体mRNA的数量为(58.0±6.2)%，显著高于正常对照组的(34.8±9.8)%(P <0.05)。

　　3 讨论

　　目前研究已证实，在鼠、猫、犬及人类的膀胱体与底部有M受体分布，此受体兴奋，可使膀胱收缩。M受体按药理学特征分为M1～M5 5种亚型[2]，膀胱中仅有M2和M3两种亚型。M3受体是介导膀胱逼尿肌收缩的主要受体[3];虽然M2受体在数量上占绝对优势，但它只能通过抑制逼尿肌舒张而间接地介导逼尿肌收缩[4]。

　　M3受体与G蛋白耦联，当节后胆碱能纤维释放的乙酰胆碱作用于突触后M3受体时，通过一系列蛋白酶的激活及钙通道的开放从而引起逼尿肌收缩[5]。实验诱导的DM大鼠会产生膀胱体积增大、排尿功能障碍、排尿次数增加等现象[6]。STZ诱导的DM大鼠会产生明显的膀胱形态学改变，我们的研究证实了其膀胱逼尿肌损害的存在。已有报道称膀胱的胆碱能受体密度比正常上升了[7]。本次研究结果显示与正常对照组相比，STZ造模的2型DM组大鼠膀胱的M3受体mRNA在DM早期都增高了，这可以解释长期以来观察到的毒蕈碱类胆碱药物刺激DM性膀胱平滑肌后收缩力增加的现象。原因可能是副交感神经功能低下，在导致逼尿肌活动低下的同时也会导致突触后M3受体代偿性上调以维持逼尿肌的收缩功能，这可能是对逼尿肌活动下降的一种代偿。

　　所以，建立稳定的DM大鼠模型，认识DM大鼠膀胱超微结构及M3受体表达的改变，能为预防、治疗DM所致膀胱病理改变，解决DM性神经源性膀胱这一临床难题提供科学依据。在此基础上，为今后研究有关药物防治DM所致膀胱病变提供一些评价指标。

　　【参考文献】

　　[1] Mumtaz FH, Thompson CS, Khan MA, et al. Alterations inthe formation of cyclic nucleotides and prostaglandins inthe lower urinary tract of the diabetic rabbit[J]. Urol Res,1999, 27(6):470-475.

　　[2] Takeuchi T, Yamashiro N, Kawasaki T, et al. The role ofmuscarinic receptor subtypes in acetylcholine release fromurinary bladder obtained from muscarinic receptor knock-out mouse[J]. Neuroscience, 2008, 156(2):381-389.

　　[3] Michel MC, Parra S. Similarities and differences in the auto-nomic control of airway and urinary bladder smooth muscle[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2008, 378(2):217-224.

　　[4] Matsumoto M, Watanabe T, Miyagawa I. Effects of long-term estradiol treatment on the contractile response tomuscarine and muscarinic receptor subtypes in the bladderof aged female rats[J]. Biomed Res, 2007, 28(6):309-314.

　　[5] Takizuka A, Minami K, Uezono Y, et al. Dexmedetomidineinhibits muscarinic type 3 receptors expressed in Xenopusoocytes and muscarine-induced intracellular Ca2+ elevationin cultured rat dorsal root ganglia cells[J].NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol, 2007, 375(5):293-301.

　　[6] Jiang YJ, Gong DX, Liu HB, et al. Ability of alpha-lipoicacid to reverse the diabetic cystopathy in a rat model[J].Acta Pharmacol Sin, 2008, 29(6):713-719.

　　[7] Stevens LA, Sellers DJ, McKay NG, et al. Muscarinic recep-tor function, density and G-protein coupling in the overac-tive diabetic rat bladder[J]. Auton Autacoid Pharmacol, 2006,26(3):303-309.