泽桂癃爽对实验性自身免疫性前列腺炎大鼠前列腺IFN-γ和IL-4的影响

　　作者：木海琦，杨森，张磊，陈映鹤 作者单位：(1.温州医学院附属第二医院 泌尿外科，浙江 温州 325027;2.华中科技大学同济医院 泌尿外科，湖北 武汉 430000)

　　【摘要】 目的 ：探讨泽桂癃爽(Zegui Longshuang)对实验性自身免疫性前列腺炎大鼠前列腺组织IFN-γ和IL-4表达的影响。方法：将Wistar大鼠随机分为EAP模型阳性对照组、泽桂癃爽干预组(0.9 g·kg-1)和阴性对照组。以Wistar大鼠前列腺蛋白提纯液辅以完全弗氏佐剂和百白破疫苗制作EAP模型。通过HE染色观察各组前列腺组织炎性细胞浸润情况，通过电镜观察前列腺细胞及细胞周围超微结构的变化，应用半定量RT-PCR法检测前列腺组织IFN-γ和IL-4的含量。结果：与EAP阳性对照组比，泽桂癃爽干预组大鼠的前列腺炎性细胞浸润减轻，前列腺组织的IFN-γ降低(P<0.01)，IL-4升高(P<0.05)，差异均有显著性。结论：泽桂癃爽可降低前列腺组织IFN-γ含量，提高IL-4的含量，减轻EAP的前列腺组织炎症浸润。

　　【关键词】 泽桂癃爽;实验性自身免疫性前列腺炎;IFN-γ;IL-4

　　The effects of Zegui Longshuang on IFN-γ and IL-4 mRNA in prostate of rats with experimental autoimmune prostatitis MU Hai-qi*， YANG Sen， ZHANG Lei， CHEN Ying-he. *Department of Urinary， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou， 325027

　　Abstract: Objective: To explore the effects of Zegui Longshuang on IFN-γ and IL- 4 in prostate of rats with experimental autoimmune prostatitis. Methods: Wistar rats were randomly divided into three groups: EAP model positive control group (Group 1)， Zegui Longshuang treatment group (0.9 g·kg-1) (Group 2)， and negative control group (Group 3). Male rats were intradermally immunized with a saline extract of male rat prostate glands (RPG) in Freund’s complete adjuvant (FCA) and Pertussis-Diphtheria-Tetanus vaccine into EAP model; To observe the infiltrate of inflammatory cell of each group by HE staining， the ultrastructure of the prostate cells and cells’ surrounding was observed under electron microscopy，and the expression of IFN-γ and IL-4 in prostate were detected with semi-quantitative RT-PCR. Results: Inflammatory cell in prostate of Zegui Longshuang treatment group showed lower infiltration than EAP model positive control group ; Compared with EAP model positive control group， expression of IFN-γ in prostate of Zegui Longshuang treatment group was lower (P<0.01)， and expression of IL-4 in prostate was higher(P<0.05). Conclusion: Zegui Longshuang can decrease IFN-γ in prostate，elevate IL-4 and relieve inflammatory infiltration of EAP prostate.

　　Key words: Zegui Longshuang;experimental autoimmune prostatitis;IFN-γ;IL-4

　　慢性前列腺炎一直是男科和泌尿外科的常见疾病和要解决的重要问题之一，发病率较高，其中又以慢性非细菌性前列腺炎的发病率最高[1]。对发病机制的研究上，多位学者[2-3]通过基础实验发现，自身免疫在慢性非细菌性前列腺炎的整个发病机制中起着重要的作用。目前对该病的治疗非常困难且疗效不尽如人意，症状迁延不愈，反复发作，严重地影响患者的全面生活质量[4]。抗生素作为经验用药，仍然被较多临床医师采用。在此基础上，抗生素加用α-受体阻滞剂、免疫调节剂等的应用，在临床治疗上获得了满意的疗效[5]。但长期运用抗生素的缺陷是显而易见的。有关中医药治疗前列腺炎的报道越来越多，且其在临床症状的改善、前列腺局部炎症消退等方面均取得了较好的疗效。因此，本研究选用临床上主要治疗膀胱瘀阻型良性前列腺增生及慢性前列腺炎的常用中药胶囊——泽桂癃爽胶囊，来治疗实验性自身免疫性前列腺炎(experimental autoimmune prostatitis，EAP)大鼠模型，观察模型动物前列腺的组织学变化，测定IFN-γ和IL-4含量，了解泽桂癃爽对前列腺炎局部免疫的影响，进一步阐明其对自身免疫性前列腺炎的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物、药品与试剂

　　1.1.1 动物：用于制模的大鼠：Wistar大鼠29只，雄性，180～220 g，清洁级;用于提取前列腺蛋白的大鼠：Wistar大鼠15只，雄性，240～300 g，清洁级。均由上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

　　1.1.2 主要药品、试剂：泽桂癃爽胶囊，购自江苏正大天晴药业股份有限公司，批号080606(灌胃时以无菌蒸馏水配制)，福氏完全佐剂(FCA)购自Sigma公司，百白破疫苗由温州市卫生防疫站提供，0.5% TritonX-100的生理盐水(自配)，0.1 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液(自配)，Trizol(Invitrogen公司)，氯仿和异丙醇(BBI公司)，DEPC水和5×TBE缓冲液(上海生工生物工程技术服务有限公司)，琼脂糖Agarose(Biowest公司)，RT-PCR试剂盒(Fermentas公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物分组：29只Wistar大鼠随机分成3组：①阳性对照组(n=10);②泽桂癃爽干预组(n=9);③阴性对照组(n=10)。

　　1.2.2 大鼠前列腺蛋白提纯液的制作：取240～300 g雄性Wistar种大鼠15只，脱颈椎处死，在无菌条件下剥取前列腺组织，用冷生理盐水洗净，加入含0.5% TritonX-100的生理盐水溶液，在冰水浴上用玻璃匀浆器制成匀浆，10 000 r/min离心30 min，取上清液，采用比浊法进行蛋白含量测定，最后用0.1 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液稀释浓度至15 mg/mL。

　　1.2.3 EAP动物模型制作：参照文献[6-7]的方法。大鼠以5%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹腔注射百白破疫苗0.5 mL，多点皮下注射15 mg/mL大鼠前列腺蛋白提纯液和FCA乳剂(比例为1:1的混悬液)1.0 mL。阳性对照组制作模型后正常喂养;阴性对照组分别行腹腔及皮内多点注射0.9%生理盐水注射液1.0 mL，制作完成后正常喂养;泽桂癃爽干预组是在制作EAP模型第8周，开始予泽桂癃爽粉末水溶液按0.9 g·kg-1连续灌胃1周[13]。所有大鼠于第9周脱颈椎处死，取前列腺进行病理学检查、透视电镜观察和IFN-γ、IL-4含量测定。

　　1.2.4 组织病理学检查：取部分前列腺组织经福尔马林固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察大鼠前列腺腺腔及间质的炎性细胞浸润情况。

　　1.2.5 透视电镜观察：将大鼠前列腺组织切成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，投入2.5%戊二醛及1%锇酸中双重固定，用递增浓度的丙酮梯度脱水，用Epon812环氧树脂包埋，经超薄切片机切片后，用醋酸铀、柠檬酸铝双重染色，透射电镜观察。

　　1.2.6 半定量RT-PCR：采用Trizol一步抽提法提取总RNA。将提取的RNA根据半定量RT-PCR试剂盒(TaKaRa)说明合成cDNA。PCR引物采用Pubmed上相应基因的参考序列，通过primer 5.0自行设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;根据说明完成PCR后，取PCR产物5μL，用1.5%的琼脂糖凝胶(EB，0.5μg·mL-1)电泳，用Gel Documentaion System (Biosens SC6200)凝胶成像系统和Gel-Pro 3.1分析结果，以目的基因与β-actin的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。

　　1.3 统计学处理方法 组间差异采用q检验。

　　2 结果

　　2.1 病理学检查结果 阴性对照组前列腺组织结构完整，无明显炎性细胞浸润或水肿;EAP阳性对照组大鼠的前列腺腺体局部组织结构遭到不同程度的破坏，不均匀的组织增生或萎缩，周围纤维组织增生，间质水肿，可见弥漫的淋巴细胞浸润;泽桂癃爽干预组大鼠的前列腺部分腺体结构异常及轻度的慢性炎症表现，间质水肿程度减轻，淋巴细胞浸润减少(见图1)。

　　2.2 透视电镜观察结果 阴性对照组可见腺体组织细胞为单层柱状上皮，胞质内可见数量较少的线粒体小，丰富的粗面内质网呈指纹状有序排列， 核形规则，核仁明显，腺泡周围包绕少量平滑肌细胞，细胞之间有桥粒。阳性对照组前列腺细胞，可见线粒体数量明显增多增大，色深浓聚，异常丰富的粗面内质网重度扩张成空泡状，腺腔内可见大量粗大的金属样分泌颗粒，细胞核形状不规则，核仁浓染。这些病理表现与正常对照组间存在着明显差异。泽桂癃爽干预组超微结构表现为粗面内质网中度扩张，线粒体增多不明显，部分胀大，结构改变远不如阳性对照组明显(见图2)。

　　2.3 炎性因子变化 如表1所示 ①IFN-γ的变化：EAP模型阳性对照组的IFN-γ水平较泽桂癃爽干预组、阴性对照组明显增高(P <0.01)，泽桂癃爽干预组和阴性对照组之间差异无显著性(P >0.05);②IL-4的变化：泽桂癃爽干预组的IL-4水平较EAP模型阳性对照组(P <0.05)、阴性对照组升高(P<0.01)(见表1)。

　　3 讨论

　　细胞因子是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称。多种细胞因子在局部或全身，通过旁分泌或自分泌的形式影响自身或其他细胞的功能，在免疫反应中起到了很重要的作用[8]。TL等[3]按细胞因子在感染和炎症过程中所起的作用，将其分为三类：促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子、调节性细胞因子。

　　IFN-γ是一种具有代表性的促炎性细胞因子，主要由活化的Th1细胞和NK细胞分泌，通过诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、 星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达，介导局部炎症有关的免疫应答，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程，增强细胞免疫。Motrich等[9]研究表明慢性非感染性前列腺炎患者体内存在针对PSA、PAP等抗原特异性反应的淋巴细胞，在面临特异性抗原刺激时，可分泌出促炎性细胞因子如IFN-γ、IL-1β、TNF-α等。国内张磊等[10]亦通过检测慢性非感染性前列腺炎患者的EPS(expressed prostatic secretion)，发现Th1类细胞因子IFN-γ的表达明显升高，可能是炎症和损伤的主要机制。本实验EAP模型阳性对照组大鼠前列腺在病理及电镜下均出现明显的炎症浸润，IFN-γ显著升高，在经过泽桂癃爽治疗后，炎症浸润减轻，FN-γ降低，表明FN-γ变化在EAP忽视的作用。IL?是帽浠贓AP中起着不可主要由Th2细胞、肥大细胞分泌的一种调节性细胞因子，主要功能是促进初始T淋巴细胞分化成Th2细胞，促进体液免疫，抑制Th1细胞活化及分泌促炎性细胞因子如：TNF痢FN谩L?、IL?、IL?、IL?2、巨噬细胞炎性蛋白?α的作用[11]，通过下调抗原呈递细胞表面主要组织相容性II类抗原表达，抑制抗原呈递，从而抑制细胞免疫，减轻局部炎性反应。本实验观察到经过泽桂癃爽治疗后的大鼠前列腺标本IL?的水平较EAP模型阳性对照组、阴性对照组均有显著上升。

　　泽桂癃爽胶囊由泽兰、肉桂、皂角刺等中药组成，针对慢性前列腺炎的湿热毒邪蕴结下焦、肾与膀胱气化不利及气滞血瘀贯穿于疾病全过程的发病机制，起到行瘀散结、化气利水的功效[12]。国内戴岳等[13]通过基础实验，发现泽桂癃爽胶囊0.9 g·kg-1治疗EAP大鼠，可明显减少大鼠前列腺液中白细胞数目，并显著降低大鼠前列腺间质炎症细胞浸润和水肿程度。 而本次实验得出相似结果，并进一步表明，泽桂窿爽可能是通过降低促炎性细胞因子IFN茫叩鹘谛韵赴蜃覫L?，影响局部细胞因子及局部细胞免疫的水平，从而成为治疗慢性非细菌性前列腺炎的另一个作用机制。

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