铼-188和平阳霉素联合导向治疗前列腺癌的体外作用
发表时间：2009-07-02 浏览次数：746次
作者：张勇，陈维真，温星桥，梁昌盛，刘长征，高新
作者单位：中山大学 1. 附属第三医院核医学科； 2. 附属第三医院泌尿外科； 3. 中山医学院， 广东 广州 510630 【摘要】 【目的】 探讨前列腺特异膜抗原单克隆抗体7E11C5.3介导铼-188和平阳霉素（PYM）导向治疗前列腺癌细胞系LNCaP的体外作用。【方法】 以葡聚糖为中介体制备7E11C5.3-PYM偶联物，间接ELISA法测定免疫活性，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定抑菌活性。采用2-巯基乙醇直接还原法制备188Re-7E11C5.3标记物，纸层析法测定标记率和放化纯度，直线回归外推法测定免疫活性分数。四唑盐（MTT）法测定体外细胞毒作用。【结果】 7E11C5.3-PYM偶联物中7E11C5.3和PYM的克分子比为1∶54，偶联后单抗的免疫活性降低了10%～20%，偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的25%。188Re-7E11C5.3的标记率为93.16% ± 2.18%，放化纯度为95.62% ± 0.48%，免疫活性分数为74.86% ± 1.86%。7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3对LNCaP细胞的抑制作用分别强于游离PYM和188ReO4-；两者单独用药时，其半数抑制浓度（IC50）分别为（10.17 ± 2.06）?滋g/mL和（23.38 ± 3.73）×104 Bq/mL；两者联合用药时，其IC50值分别为（1.83 ± 0.20）?滋g/mL和（6.82 ± 0.73）×104 Bq/mL。【结论】 7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用显著强于单独用药。
【关键词】 前列腺肿瘤 前列腺特异膜抗原 铼-188 平阳霉素
Target Therapy Combined 188Re with Pingyangmycin on Prostate Cancer Cells in Vitro
ZHANG Yong, CHEN Wei-zhen, WEN Xing-qiao, LIANG Chang-sheng, LIU Chang-zheng, GAO Xin
1. Department of Nuclear Medicine, 2. Department of Urology, The Third Affiliated Hospital; 3. The School of Preclinical Medicine, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510630, China
Abstract: 【Objective】 To investigate the efficacy of monoclonal antibody 7E11C5.3-targeted therapy combined 188Re with pingyangmycin for the treatment of human prostate cancer cell line LNCaP in vitro. 【Methods】 Linking between 7E11C5.3 and PYM was mediated by dextran T 40. Immunoreactivity of 7E11C5.3 was determined by indirect ELISA．Bacteria inhibitory activity of the conjugate was determined by TTC assay. 188Re-7E11C5.3 was prepared by direct 2-mercaptoethanol reduction method. Labeling efficiency and radiochemical purity was measured by paper chromatography. Immunoreactive fraction was determined by linear extrapolation. Cytotoxicity to LNCaP cells was determined by MTT assay. 【Results】 The molar ratio of 7E11C5.3∶PYM was l∶54 in 7E11C5.3-PYM conjugate. The immunoreactivity of 7E11C5.3 decreased by approximately 10%-20% after conjugation. The bacteriostatic activity of PYM in the conjugate was 25％ as much as that of free PYM. The labeling yield of 188Re-7E11C5.3 was 93.16% ± 2.18%, the radiochemical purity was 95.62% ± 0.48%, and the immunoactive fraction was 74.86% ± 1.86%. The inhibitory effect of 7E11C5.3-PYM and 188Re-7E11C5.3 on cultured LNCaP cells was significantly higher than that of free PYM and 188ReO4- respectively. When separately used, the 50% inhibitory doses (IC50) of 7E11C5.3-PYM and 188Re-7E11C5.3 were (10.17 ± 2.06) ?滋g/mL and (23.38 ± 3.73)×104 Bq/mL respectively. When combined used, the IC50s of 7E11C5.3-PYM and 188Re-7E11C5.3 were (1.83±0.20) ?滋g/mL and (6.82±0.73)×104 Bq/mL respectively. 【Conclusions】 The combined use of 7E11C5.3-PYM and 188Re-7E11C5.3 displayed higher inhibitory effect on prostate cancer cells than their separate use.
Key words: prostatic neoplasms; protate specific membrane antigen; rhenium-188; pingyangmycin
对激素治疗耐药的前列腺癌（hormone refractory prostate cancer）是临床治疗中的难点[1]，对常规化疗也不敏感。导向化疗将单抗与化疗药物偶联，可以增强化疗药物的靶向性而提高疗效并降低毒性[2]，但对静止期肿瘤细胞疗效甚微；放射免疫治疗将单抗与放射性核素偶联，对静止期肿瘤细胞也能有效杀伤。因此，我们将导向化疗和放射免疫治疗联合应用于抗前列腺癌研究，选用放射性核素188Re和化疗药物平阳霉素分别与前列腺特异膜抗原单克隆抗体7E11C5.3偶联，体外观察它们对前列腺癌细胞的联合导向治疗作用。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 平阳霉素（PYM，哈尔滨博莱制药有限公司）、188W-188Re发生器（上海安盛科兴药业公司）、前列腺特异膜抗原单克隆抗体7E11C5.3（美国Cytogen公司）、正常鼠IgG（mIgG，Dako公司）、葡聚糖Dextran T-40（Pharmacia公司）、高碘酸钠（广州化学试剂厂）、硼氢化钠（Bayer公司）、2-巯基乙醇（2-ME，上海化学试剂总厂）、氯化亚锡（SnCl2，广州化学试剂厂）、Sephadex G-25（Sigma公司）、RPMI-1640培养液（Gibco公司）、胎牛血清（Hyclone公司）、考马斯亮蓝G-250（上海源聚生物科技有限公司）、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体（北京中山生物技术公司），2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC，上海试剂三厂），其它为市售分析纯。
1.2 细胞
前列腺癌细胞株LNCaP 购自北京大学泌尿外科研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液37℃、体积分数为5%CO2开放培养，用0.05%胰酶（含0.02%EDTA）消化、传代。枯草杆菌由本校基础医学院微生物教研室提供。
1.3 单抗7E11C5.3与PYM的偶联
取Dextran T-40 0.25 g，高碘酸钠0.08 g溶解于50 mL去离子水中，室温下搅拌2 h，去离子水透析16 h，冻干，得到多醛基葡聚糖（PAD）；取PAD 5 mg与PYM 10 mg混合，4 ℃避光搅拌4 h，加入7E11C5.3 2.5 mg，继续反应13 h，最后加入0.1 mg的硼氢化钠，4 ℃搅拌2 h，终止反应；反应物经Sephadex G-25（1.0 cm × 50 cm）纯化，测A595值鉴定蛋白峰位，分别收集第一峰（7E11C5.3-PYM偶联物）和第二峰（游离PYM）[3]。间接ELISA法测定7E11C5.3-PYM偶联物的免疫活性[4]，TCC法测定偶联物中PYM的抑菌活性[5]。
1.4 7E11C5.3-PYM偶联物中单抗和平阳霉素含量的计算
1.4.1 测定偶联物中单抗7E11C5.3的浓度
①分别测定质量浓度为1 g/L的7E11C5.3和PYM在595nm处的吸光度A595，结果表明PYM在595nm处的吸光度（A=0.005）远低于7E11C5.3（A=0.655），几乎无吸收。因此7E11C5.3-PYM偶联物的A595几乎全部由7E11C5.3产生，PYM可忽略。②建立单抗7E11C5.3在595 nm处吸光度的标准曲线，测定第一峰洗脱液的A595值，可查出偶联物中单抗的含量?籽7E11C5.3（=0.32 g/L）［3］。
1.4.2 测定偶联物中PYM的浓度
①测定第一峰洗脱液在280 nm处的吸光度A7E11C5.3-PYM（=0.649）；②配置7E11C5.3质量浓度为0.0625～0.1 g/L的系列溶液，以生理盐水为空白对照，测定各溶液在280 nm处的吸光度，绘出标准曲线，作直线回归，其斜率即为7E11C5.3在280 nm处的百分吸光系数E1%1cm（14.1）；根据公式A= E1%1cm×光径（1cm）×?籽7E11C5.3可求出A7E11C5.3-PYM中7E11C5.3所占的吸光度A7E11C5.3（0.451）；根据光吸收的加合性，APYM=A7E11C5.3-PYM-A7E11C5.3=0.649－0.451=0.198；③如上法求得PYM在280 nm处的百分吸光系数E1%1cm（7.6）；同样根据公式?籽=APYM÷（E1%1cm×光径）可求出测定偶联物中PYM的浓度?籽PYM（0.26 g/L）［6］。
1.5 188Re标记7E11C5.3 采用2-巯基乙醇直接还原法制备188Re-7E11C5.3标记物，纸层析法测定标记率和放化纯度，直线回归外推法测定免疫活性分数[7]。
1.6 188Re-7E11C5.3体外稳定性检测 取经Sephadex G-25纯化后的188Re-7E11C5.3 100 μL，加入到2 倍体积小牛血清中，37℃温育24 h，分别于1、4、12、24 h取样测定放化纯度。
1.7 免疫偶联物对前列腺癌细胞作用的观察 采用MTT法取对数生长期的LNCaP细胞，以每孔5×103个细胞种于96孔培养板上，培养48 h待贴壁后倾去培养液，加入以无血清1640倍比稀释的各组药物各200 ?滋L／孔，每浓度设5个平行孔，对照孔加无血清1640 200 ?滋L。培养1 h后吸去药物，加入新鲜培养液继续培养72 h，各孔加无血清1640配置的MTT（5 mg/mL） 20 ?滋L，37 ℃孵育4 h，吸去上层培液，每孔加入DMSO 150 ?滋L，室温轻摇至蓝色结晶完全溶解，全自动酶标仪测490 nm吸光度。重复实验，计算抑制率和半数抑制浓度（IC50）值。各组药物如下：（1）导向化疗组：①7E11C5.3-PYM；②游离PYM。PYM浓度均取3.12、6.25、12.5、25、50 ?滋g/mL。（2）放射免疫治疗组：①188Re-7E11C5.3；②188Re-mIgG；③188ReO4-。放射活度均取11.56、23.12、46.25、92.5、185 × 104 Bq/mL。（3）联合用药组：①7E11C5.3-PYM 0.78 ?滋g/mL ＋ 188Re-7E11C5.3 2.89 × 104 Bq/mL（0.78 ?滋Ci/mL）；②～⑤组分别取7E11C5.3-PYM 1.56、3.12、6.25、12.5 ?滋g/mL相应联合188Re-7E11C5.3 5.78、11.56、23.12、46.25 × 104 Bq/mL。
1.8 统计学处理 实验数据以均数 ± 标准差表示，样本均数的比较采用SPSS 8.0统计软件行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 7E11C5.3-PYM偶联物的制备及鉴定 单抗7E11C5.3与PYM的偶联物经Sephadex G-25分离，可获得两个峰（图1），第一峰既有抗体活性，又有抑枯草杆菌活性，为7E11C5.3-PYM偶联物；第二峰仅有抑菌活性，为未与抗体结合的游离PYM。偶联物中7E11C5.3（相对分子量约100 k）含量为0.32 g／L，PYM含量（相对分子量1.5 k）为0.26 g／L，两者分子比为1∶54。ELISA法检测偶联物的抗体活性较偶联前下降了约10%～20％（图2）。TTC法检测偶联物中PYM的抑菌活性约为标准PYM的25%。
2.2 7E11C5.3-PYM偶联物对前列腺癌的细胞毒作用 7E11C5.3-PYM及游离PYM对LNCaP细胞的细胞毒作用均呈剂量依赖性关系（表1），其IC50值分别为（10.17 ± 2.06）?滋g/mL和（30.01 ± 5.22）?滋g/mL（P＝0.004）。
2.3 188Re-7E11C5.3偶联物的制备及鉴定 单克隆抗体7E11C5.3经过2-ME还原，在亚锡-柠檬酸酒石酸溶液中与188Re结合形成188Re-7E11C5.3，纸层析法测定其标记率为93.16%± 2.18%，放化纯度为95.62% ± 0.48%，比活度为（286.74 ± 6.16）×106 Bq/mg；在37℃下2 倍体积的小牛血清中1、4、12、24 h的放化纯度分别为95.85%、90.22%、85.46%、80.51%；直线外推法测定其免疫活性分数为74.86% ± 1.86%，直线回归方程为T/B=1.3256+0.1531×1/?籽。
2.4 188Re-7E11C5.3偶联物对前列腺癌的细胞毒作用 188Re-7E11C5.3，188Re-mIgG和188ReO4-对LNCaP细胞均有杀伤作用，且呈剂量依赖性关系（表2），其IC50值依次为（23.38 ± 3.73）×104 Bq/mL，（59.21 ± 8.02）×104 Bq/mL和（68.89 ± 10.91）×104 Bq/mL。统计学分析显示188Re-7E11C5.3的IC50值显著低于188Re-mIgG（P＝0.002）和188ReO4-（P＝0.000），188Re-mIgG和188ReO4-的IC50值无显著差异（P＝0.194）。
2.5 7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3联合用药对前列腺癌的细胞毒作用 188Re-7E11C5.3和7E11C5.3-PYM联合用药对LNCaP细胞的杀伤作用也呈剂量依赖性关系，①～⑤组的抑制率（%）分别为：18.77 ± 1.16、45.82 ± 2.52、69.14 ± 4.54、87.85 ± 5.66、96.66 ± 1.35，联合用药时188Re-7E11C5.3的IC50值为（6.82 ± 0.73）×104 Bq/mL，7E11C5.3-PYM的IC50值为（1.83 ± 0.20）?滋g/mL，分别低于它们单独用药时的IC50值（23.38 ± 3.73）×104 Bq/mL（P＝0.002）和（10.17 ± 2.06）?滋g/mL（P＝0.002）。
3 讨论 前列腺特异膜抗原（PSMA）被认为是导向诊断和导向治疗前列腺癌最有意义的靶蛋白[8]，其单抗7E11C5.3已被美国FDA批准应用于临床显像诊断前列腺癌转移病灶[9]。PYM是临床常用的广谱抗癌抗生素，对前列腺癌细胞有较强的生长抑制作用[10,11]。188Re具有良好的核物理与生物学特性，既适合内照射治疗又可显像。因此，我们采用PYM和188Re标记7E11C5.3，探讨其联合治疗前列腺癌的效果。 本研究采用MTT法比较了3组药物对LNCaP的抑制作用，第1组是7E11C5.3-PYM与游离PYM比较，第2组是188Re-7E11C5.3与188Re-mIgG和188ReO4-比较（mIgG是对LNCaP的无关抗体），结果显示，7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3对前列腺癌细胞的抑制作用分别强于游离PYM和188ReO4-，表明单抗可以增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。第3组是7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3联合用药与各自单独用药的比较，结果显示，联合用药时各药的IC50值明显减少，表明联合用药具有低剂量、高疗效的优点，其可能机制：①内照射治疗和化疗的双重作用，加强疗效；②PYM是放疗增敏剂，增加了前列腺癌细胞对188Re治疗的敏感性。 由于偶联反应对抗体和PYM的活性影响较大，本文是将188Re和PYM分别与7E11C5.3进行偶联，如果能进一步摸索出较为理想的方法将188Re直接标记到7E11C5.3-PYM上，制备成放射免疫化学治疗剂，其抑癌效果应会进一步增强。
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