脑缺血再灌注后炎症和自由基作用的实验研究

　　作者：薛晶 冯加纯 杨艺敏 李艳华 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 动态观察大鼠脑缺血再灌注后的早期损伤。方法 将100只大鼠随机分为假手术组50只、脑缺血再灌注组50只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型，脑缺血2 h后再灌注0、6、12、24、48 h取材，假手术组在术后相对应脑缺血再灌注组各时间点取材，免疫组化法测NFκBp65、IL1β，化学比色法测MDA、SOD，TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 与假手术组相比，大鼠大脑中动脉缺血2小时后再灌注0～12 h时MDA含量逐渐增加(P<0.000 1)且12 h达高峰，0～12 hSOD活性逐渐减低(P<0.000 1)，0～24 h NFκBp65、IL1β蛋白表达及凋亡细胞数逐渐增加(P<0.000 1)且24 h达高峰。结论 本实验构建了研究大鼠大脑中动脉缺血2 后再灌注不同时间炎症反应和自由基损伤的实验动物模型，为在最佳时间点观察药物干预自由基和炎症反应提供了实验依据。

　　【关键词】 脑缺血再灌注;炎症;自由基

　　大量研究已证实脑梗死后脑组织因缺血缺氧会出现酸中毒、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症因子及自由基生成等一系列的瀑布反应，最终导致细胞死亡或凋亡〔1，2〕,故早期干预非常重要。但目前对脑梗死早期的炎症反应尚无明确有效的药物治疗。因此本研究在制作大鼠大脑中动脉缺血模型基础上观察脑缺血再灌注早期炎症反应和自由基生成在时间上的动态变化，寻找各指标的表达峰值，以期为临床选择干预治疗的时机及在最佳时间点观察药效提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　普通级健康雄性Wistar大鼠100只,体重280～300 g,由吉林大学动物中心提供，随机分为假手术组、脑缺血再灌注组各50只，分别按脑缺血2 h后再灌注0、6、12、24、48 h分为5个亚组。参照ZeaLonga线栓法〔3〕制作大鼠大脑中动脉缺血模型并略加改进，选用市售尼龙鱼线，直径0.28 mm,截取4 cm长的线段若干根,头端用砂纸打磨去除棱角,距头端18 mm和20 mm处各做一标记，酒精消毒,肝素浸泡后烘干备用。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，仰卧固定，常规备皮消毒，颈正中切口，从肌群间向深部分离暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，避免损伤迷走神经，翼腭动脉不予分离,电凝ECA分支，ECA 近心端及远心端挂线结扎,从结扎点间剪断，使ECA远端游离，微动脉夹暂时夹闭CCA 近心端及ICA近心端，ECA残端根部留置丝线备用，在ECA残端根部垂直血管壁剪一小口，与鱼线直径大致匹配，将头端处理过的鱼线插入ECA至分叉处时牵拉ECA残端使其与ICA在一条直线上，继续送入鱼线，移走ICA上的动脉夹，利用鱼线盘绕时形成的自然弧度，将鱼线头端方向对着手术对侧，可避免进入翼腭动脉，当鱼线进入18～20 mm且前端遇轻微阻力时停止进线，结扎ECA切口根部固定鱼线，松开CCA的动脉夹，逐层缝合肌肉皮肤,术毕灯照保持鼠体温在37.0℃左右,缺血2 h后再次麻醉动物,轻轻拔出鱼线至ECA残端实现再灌注。假手术组只是尼龙鱼线插入仅10 mm，其余步骤同手术组。大鼠麻醉清醒后进行神经功能评分，按ZeaLonga〔3〕5分制标准评分:0分，无神经缺损症状;1分，不能伸展对侧前爪;2分，行走时向偏瘫侧转圈;3分，向偏瘫侧倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。其中0分和4分者被剔除。凡手术中动物死亡、蛛网膜下腔出血或无对侧偏瘫体征均为模型复制失败，不计在内，用同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。

　　1.2 取材

　　脑缺血再灌注组分别于再灌注后0、6、12、24、48 h取材，假手术组在相应时间点取材。将假手术组、脑缺血再灌注组各25只用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台，剪开胸腔，暴露出心脏。以9号穿刺针插入左心室，右心房剪开一小口，首先以生理盐水向左心室注入，冲洗脑组织血管内的血液，至右心房流出的冲洗液转清后，以4%多聚甲醛自左心室灌注固定脑组织，当出现鼠的四肢及尾抖动，表明灌注成功，固定液已进入循环系统。待鼠不再出现四肢及尾的抖动，且躯干僵硬时，立即断头，迅速置于冰盘上取脑，将视交叉后脑组织2 mm厚层面浸泡于4%多聚甲醛缓冲液24 h，然后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切取同一层面5张切片，切片厚5 μm，用于检测核转录因子κB p65亚基(NFκB p65)、白细胞介素1β(IL1β)及神经细胞凋亡。另外假手术组、脑缺血再灌注组各25只将距额极2～11 mm缺血侧脑组织放入9倍量的4℃生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，用离心机3 000 r/min,离心15 min，取上清液分二份立即用于检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

　　1.3 免疫组化

　　免疫组化法检测NFκB p65(购自北京博奥森生物技术有限公司)、IL1β(购自武汉博士德生物工程有限公司)，TUNEL(购自上海罗氏公司)法检测细胞凋亡，严格按试剂盒说明书操作，显微镜观察，每只大鼠5张切片选相同部位计数阳性细胞数(400倍)，数码相机拍照。NFκB p65和IL1β阳性细胞计数胞浆呈棕褐色着色者。TUNEL阳性细胞为细胞核呈褐色者。

　　1.4 MDA、SOD的检测

　　分别用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法严格按试剂盒说明书操作(购自南京建成生物工程研究所)，并按公式计算MDA含量和SOD活力。

　　1.5 统计学方法

　　采用SAS9.0版统计软件进行资料分析，所有数据以x±s表示，多样本均数比较用方差分析，两两比较采用SNK法，两样本均数比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 动物模型神经功能缺损情况

　　假手术组动物清醒后未见明显神经功能缺损的症状和体征，缺血再灌注组动物手术清醒后出现对侧前肢屈曲、同侧霍纳征，向对侧转圈，行走时向对侧倾倒等症状，术后24 h动物神经功能缺损症状体征明显改善。

　　2.2 NFκB p65、IL1β和凋亡细胞的变化

　　假手术组各个时间点仅见少量散在点状的NFκB p65和IL1β蛋白免疫反应阳性细胞和少许凋亡细胞(P>0.05)，脑缺血再灌注组各个时间点均见大量免疫反应阳性细胞,且凋亡细胞数亦明显增多。与假手术组相比，大鼠大脑中动脉缺血2 h后再灌注0～24 h NFκB p65、IL1β蛋白表达及凋亡细胞数逐渐增加(P<0.000 1)且24 h达高峰，差异均有统计学意义。见表1，图1～图3。

　　2.3 MDA和SOD的变化

　　假手术组在各个时间点MDA含量及SOD活力均无明显变化(P>0.05)，脑缺血再灌注组0～12 h MDA含量逐渐增加(P<0.000 1)且12 h达高峰，0～12 h SOD活性逐渐减低有统计学意义(P<0.000 1)(表2)。表1 两组不同时间点NFκB p65和IL1β蛋白表达的阳性细胞数及凋亡细胞数的比较(略)表2 各组MDA含量和SOD活性的比较(略)

　　3 讨 论

　　大量研究已证实脑缺血再灌注后产生大量的自由基，自由基的作用是缺血再灌注损伤的重要发病学环节〔4〕，本研究动态观察了可反映自由基水平的MDA含量在脑缺血再灌注后的变化，发现大鼠大脑中动脉缺血再灌注后0～12 h MDA含量明显增加，同时机体为清除自由基，消耗内源性SOD，使SOD活性降低。MDA含量的增高和SOD活性的降低呈平行关系。大量自由基氧化细胞内的脂质、蛋白质和核酸，可引起细胞的损伤和死亡〔5〕。

　　TUNEL法检测脑缺血再灌注后发现凋亡细胞数明显增多，且24 h最明显。由于自由基的峰值比凋亡的峰值提前，分析自由基增加可引发细胞凋亡,但自由基水平在24 h开始下降时凋亡却正值高峰直至48 h才开始下降，这又说明脑缺血再灌注损伤的机制是复杂的，还有其他的因素参与凋亡的发生。

　　本研究还发现，脑缺血再灌注后代表炎症反应的NFκB p65、IL1β蛋白表达0～24 h明显增加，与凋亡的发生在时间上相伴行。自由基的高峰值较炎症反应和凋亡发生早，可能与脑缺血再灌注损伤时，NFκB 被氧自由基、细胞因子、钙超载等因素刺激而活化，活化的 NFκB 又可诱导细胞因子如IL1β、黏附分子、免疫受体、炎症相关酶类的表达，从而形成炎症反应的恶性循环〔6〕有关。1995 年 Salminen 等〔7〕首先提出脑缺血再灌注时的 NFκB 活性增高，并认为其与脑内炎性细胞浸润有关，此观点已被所有学者所接受。Kim等〔8〕研究发现脑组织内大量 IL1β的生成可明显加重缺血性脑损伤。IL1β作为早期产生的细胞因子具有初始炎症反应并级联放大炎症过程的作用〔9〕，诱导免疫活性细胞产生继发性细胞因子及其他炎症介质，导致炎症反应失控及引发细胞因子风暴，最终造成脑缺血后的继发性损伤。同时脑缺血再灌注后，经过上述一些级联放大反应，大量的自由基产生，并远远超过了自身内源性抗氧化系统的清除能力，故脑缺血再灌注早期的炎症反应和自由基损伤可能是造成脑缺血后迟发性神经元死亡的重要因素，早期对此两种因素进行干预治疗，将对减轻脑缺血再灌注损伤有重要意义，新型自由基清除剂依达拉奉的问世已为脑梗死患者带来了福音，但目前对脑梗死早期的炎症反应尚无明确有效的药物治疗。

　　本实验发现脑缺血再灌注后反映自由基和炎症反应的指标是呈动态改变的。12 h自由基增加达高峰，24 h炎症反应和细胞凋亡达高峰，故可选择这些指标达高峰的时间点研究药物对其干预作用，为选择干预治疗的最佳时机提供理论依据。

　　【参考文献】

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　　7 Salminen A，Liu PK，Hsu CY.Alteration of transcription factor binding activities in the ischemic rat brain〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1995;212(3):93944.

　　8 Kim JS.Cytokines and adhesion molecules in stroke and related diseases〔J〕.Neurol Sci,1996;137(2):6978.

　　9 Gibson RM，Rothwell NJ,Le Feuvre RA.CNS injury：the role of the cytokine IL1〔J〕.Vet J,2004;168(3):2307.