大鼠腹主动脉瘤形成过程中T细胞及CD4+CD28-T细胞的动态变化及意义

　　腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm,AAA)是一类发病机制尚不明确的主动脉扩张性疾病，主要病理表现为动脉瘤局部大量炎症细胞浸润，其中以T淋巴细胞(T细胞)、巨噬细胞(macr叩hakes)的浸润最为显著。f一I前国内关于T细胞在腹主动脉瘤发病机制中的作用报道较少。本研究通过动态观察大鼠腹主动脉瘤形成过程中，动脉局部T细胞的浸润情况及外周血CD4+CD28一T细胞亚群的分布变化，初步探讨其在腹主动脉瘤发病机制中的作用。　　材料与方法　　一、材料　　1.实验动物:Wistar雄性大鼠50只(由南方医利大学实验动物中心提供，清洁级，动物号200}1024}to周龄，体重210一22s，随机分成s组，每组to只。A组为正常对照组，另外40只分别为B组(术后第3天),C组(术后第7天),D组(术后第14天),E组(术后第28天)。术前4一5只一笼群养，术后独笼饲养，每日光照12h，自主饮水进食2.实验动物分组及模f!J建立:按我们既辛l.}l勺方法建立大鼠腹主动脉瘤模型‘:大鼠常规消毒麻醉后，腹部正中切日，显露腹主动脉，游离出肾动脉水平以下腹主动脉1cm，游离左侧骼总动脉约1cm,远端3-0丝线结扎，近端进套管针一至腹主动脉阻断部位下0.3cm处，在近腹主动脉分叉处以0号丝线活扎腹主动脉，固定套管针，以微量注射泵加压灌注猪胰弹力蛋白酶(试剂购于美国Sigma公司)灌注结束后，剪断腹主动脉远端结扎线，拔除套管针，结扎左侧骼总动脉，取下腹主动脉近端动脉夫.恢复腹主动脉血_流3-0丝线缝合后腹膜,0号丝线逐层关腹。　　二、方法　　1.腹主动脉形态观察和标本采集:用游标卡尺分另oI测量各组大鼠灌注前腹主动脉直径、取标本时灌注段腹主动脉最大直径并计算直径扩张率，直径扩张率=(灌注后直径一灌注前直径)/灌注前直径Xloo%，腹主动脉直径扩张率>loo%判定为腹主动脉瘤的形成[2术后第3,7,14,28天，动物空腹状态下腹腔麻醉.开腹，分离腹主动脉周国组织游离出腹主动脉及右侧骼总动脉，测量腹主动脉扩张率。直接心脏采血留取血液标本(1:sml肝素抗凝)，用于流式细胞检测;随后处死，取腹主动脉，立即4%的多聚甲醛固定，用于常规形态学检查及免疫组化分析(二2.大鼠腹主动脉病理结构观察和免疫组化分析:运用HE染色法和EVG弹力蛋白和胶原纤维特殊染色法，分别观察各组大鼠腹主动脉标本的病理结构改变。HE染色由自动染色仪完成E丫(;染色过程同前m染色结果判断:弹力纤维染成蓝黑色，胶原纤维染成红色，肌纤维、红细胞染成黄色同一标本之相邻切片用兔抗鼠CD3多克隆抗体(T细胞染色)、CD68抗体(巨噬细胞)、CD20抗体(B细胞)染色，多克隆抗体检测试剂盒购自武汉博士德公司。免疫组化的结果判定:均由2人于400倍光镜下计数单位视野(10个)阳性细胞，并计算阳性细胞占细胞总数的百分比。以PBS作阴性对照，胞质或胞膜呈棕黄色沉淀为阳性。　　3.流式细胞检测各组大鼠血液中CD4十、CD8十、CD4+,CD28-T细胞亚群占淋巴细胞的比例:取100闪新鲜个血各加10闪三色荧光标记的T淋巴细胞单抗，分别标记为.A管(100闪全血+10闪单克隆抗体CD3PerCP,CD4-PE,CD8FITC),B管(100闪全血+10闪单克隆抗体CD4-PE,CD28一FITC),C管(100闪全血+10闪单克隆抗体CD8一PE,CD28一FITC;同时对照组(100闪全血+10闪单克隆抗体IgC-FITC,IgG-PE,IgG-PE作为对照;大鼠流式抗体购自美国BD公司。卜述标本在室温、暗室内孵育20min.加溶I(1l‘剂2ml,混匀裂解红细胞10min,1500r/min离心10min，去上清后分别用PBS溶液2.5ml清洗两遍;加PBS溶液0.5ml,混匀后应用流式细胞仪检测分析(若不能马上分析，可以加用0.5ml1%多聚甲醛固定液，室温下闭光保存，24h内上机检测)所得数据经CellQustPlot软件分析获得二、统计学处理)、认用SPSS13.0统计软件进行分析计量资料以见士，、表示，多组间差异比较计量资料采用。ne-jsasANO}'A，组间多重比较采用LSD法，计数资料用FisherExact检验，P<0.OS为差异有统计学煮义-结果一、腹主动脉大体形态改变各组大鼠术前腹主动脉直径差异无统计学意义(P=0.152)正常对照与B组腹主动脉扩张率差异尤统士卜学意义(P>0.05),与C,D,E组比较其扩张率差异有统计学意义(I'=0.002)(表1)。术后}a腹主动脉开始扩张，术后7一14}}腹主动脉呈加速扩张，术后14a腹主动脉瘤形成，局部动脉明显粘连、变硬。此后腹主动脉不再继续扩张。正常对照组腹主动脉大体形态无明显改变(图i一4)。　　二、各组大鼠腹主动脉HE及特殊染色结果　　病理切片HF染色及I1JVG染色发现:正常对一照组动脉中层弹力纤维清晰可见，内皮细胞与平滑肌细胞排列整齐;术后3一7<1，动脉中层弹力纤维部分扭曲断裂，内皮细胞与平滑肌细胞排列紊乱;术后14d及28d，动脉壁结构破坏明显，中膜弹力纤维断裂、消失，平滑肌细胞凋亡，外膜较多炎性细胞浸润.　　三、各组大鼠动脉壁免疫组织化学分析　　正常对照组动脉未见明显的炎性细胞浸润与正常对照组比较，术后14d组大鼠腹主动脉3种细胞表达均有明显升高(P=0.02)术后7dT淋巴细胞的表达即有显著升高(P=0.03),8细胞及巨噬细胞有升高，但差异无统计学意义(P=0.28(表2)。　　四、各组大鼠血液中CD4一、CD4一CD28一T细胞亚群检测与正常对照组比较，术后各组大鼠血浆中CD4十占T细胞比例差异无统计学意义(P=0.33);与正常对照组比较，术后各组CD4十CD28一T细胞均有显著升高，以术后7d升，高最为显著(P=0.001)(表3)。　　讨论　　对人腹主动脉瘤的病理研究显示:动脉局部大量炎症细胞浸润及免疫细胞的激活是其主要病理特征3因而自身免疫损伤在腹主动脉瘤形成和发展过程中的作用受到高度关注。T淋巴细胞是细胞免疫反应的核心环节，为明确T细胞在腹主动脉瘤免疫发生发展中的作用，本研究动态观察大鼠腹主动脉瘤形成过程中，动脉局部r细胞的浸润情况及外周血CD4-CD28一T细胞亚群的分布变化，并以此为切八点探讨腹主动脉瘤发病机制中自身免疫特点。　　CD4一CD28一T细胞是一类特殊的T细胞亚群，具有独特的促炎功能，可产生高水平的IFN-y,TipF-a等促炎症细胞因子。这些促炎症细胞因子通过活化巨噬细胞，诱导细胞外基质金属酶(MMPs)的大量表达，导致动脉中层弹力蛋白的降解。另一力一面,CD4十CD28一T细胞还具有独特的细胞毒效应，可引起血管内皮细胞的损害和血管平滑肌细胞凋亡我们既往的研究发现5，在不同发展阶段的腹主动脉瘤患者中，外周血干扰素y(IFN-y、肿瘤坏死因子。(TNF-a)表达水平显著升高。同时CD4一CD28一T细胞比例在}A患者中显著升高，其中以小A}A患者中升高最为显著。这一结果提示在.-}.AA发生发展的过程中，机体存在全身免疫反应的激活，CD4+CD28一T细胞在AAA形成早期可能起着重要的促进作用。　　在本研究中我们观察到，在腹主动脉瘤形成早期，动脉局部即有明显T淋巴细胞的浸润，随着腹主动脉的加速扩张，动脉局部的T,B细胞及巨噬细胞表达呈显著升高，这一结果与Ocana等“{观察结果相一致。同时，大鼠外周血T细胞亚群也发生明显变化，CD4十CD28一T细胞在腹主动脉瘤形成早期明显升高。随着腹主动脉瘤的形成，CD4十CD28一1细胞较AAA形成早期略有下降CD4+CD28一T细胞在AAA形成早期大量表达，提示其在AAA形成早期可能起着重要的炎症和免疫触发作用。在各种慢性抗原的持续刺激下，CD4十CD28一T细胞异常增殖川，通过其促炎症作用和细胞毒作用，促进炎症和免疫介质的异常表达，导致腹主动脉局部细胞外基质重构、弹力纤维受损及血管平滑肌细胞大量凋亡，最终导致腹主动脉瘤的形成及扩张3。随着腹主动脉瘤的形成，CD4十CD28一T细胞呈下降趋势。　　发生这一现象的机制尚不清楚，推测其原因可能为:随着腹主动脉的进一步扩张，Thl细胞因子炎症反应持续增长，Th2等抗炎因子随之异常持续增高，表现出代偿性抗炎反应综合征，并通过某种途径刺激使CD4+CD28一T细胞分泌减少T淋巴细胞的浸润及其亚群比例变化，介导动脉局部及体内免疫及炎症反应的发生，可能是早期腹主动脉瘤的免疫发病机制的重要环节犷9。但其具体过程和机制不清楚，尚须进一步研究。通过评估CD4rCD28-T细胞变化规律，对AAA扩张率的预测以及以此为靶点进行针对性的药物干预，可能有一定的作用。　　参考文献　　许文平,邱健,詹纯列. Wistar大鼠腹主动脉瘤模型的建立及改进[J].医学研究生学报,2009,(4):347-349.doi:10.3969/j.issn.1008-8199.2009.04.004.　　中华医学会外科学分会血管外科学组. 腹主动脉瘤诊断与治疗指南[J].中国实用外科杂志,2008.916-918.　　Lindholt JS,Shi GP. Chronic inflammation,immune response,and infection in abdominal aortic aneurysms[J].European Journal of Vascular and Endovascular Surgery,2006.453-463.　　许文平,邱健,李志梁. 阿托伐他汀抑制腹主动脉瘤基质金属酶9及核因子кB表达的实验研究[J].中国动脉硬化杂志,2008,(8):600-602.doi:10.3969/j.issn.1007-3949.2008.08.004.　　许文平,李志梁,邱健. 腹主动脉瘤患者外周血CD4+ CD28-调节性T细胞的变化及意义[J].中国普通外科杂志,2011,(6):651-654.　　Ocana E,Bohorquez JC,Perez-Requena J. Characterisation of T and B lymphocytes infiltrating abdominal aortic aneurysms[J].Atheroclerosis,2003.39-48.　　荣忠厚,吴河水,杨智勇. 重症急性胰腺炎患者外周血CD4+ CD25 high调节性T细胞的动态变化研究[J].中华普通外科杂志,2010,(12):992-994.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-631X.2010.12.017.　　许文平,邱健,丁力. 腹主动脉瘤发病机制及内科治疗进展[J].实用医学杂志,2006,(9):1086-1088.doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2006.09.052.　　Kuivaniemi H,Platsoucas CD,Tilson MD. Aortic aneurysms an immune disease with a strong genetic component[J].Circulation,2008.242-252.