Survivin COX-2在非小细胞肺癌中的表达及意义

作者:牛艳清,于建宪

作者单位：1 长治医学院病理学教研室(046000) 2 青岛市市立医院

    【摘要】  目的：观察Survivin、COX-2在NSCLC及非肿瘤性病变肺组织中的表达，探讨它们在NSCLC发生发展中的作用及相互关系。方法：制作71例NSCLC和21例非肿瘤性病变肺组织共92例的组织芯片，采用免疫组化技术检测Survivin、COX-2的表达。结果：①Survivin、COX-2在NSCLC组织中的阳性表达率分别为71.83%、77.47%，均显著高于非肿瘤性病变肺组织（19.05%、14.29%）。Survivin的阳性表达仅与TNM分期有关；COX-2的表达与肺癌组织的病理类型有关。②NSCLC组织中Survivin与COX-2表达呈正相关。结论：Survivin、COX-2相互协同，共同参与NSCLC的发生、发展。

【关键词】  Survivin COX-2 非小细胞肺癌 组织芯片

    Expression and significance of Survivin  COX-2 in non-small-cell lung cancer

    Niu Yanqing,Yu Jianxian

    Department of Pathology, ChangZhi Medical College

    Abstract  Objective：To study the expression and significance of Survivin、COX-2 in NSCLC and benign lesion tissue,discuss the action of Survivin、COX-2 in the occurance and development of NSCLC,and the relationship between their expression.Methods:The tissue microarray was made up of 71 cases of NSCLC tissue and 21 cases of benign lung lesion tissue.The expression of  Survivin、COX-2  were  detected by immunohistochemistry.Results:①The positive expression rate of Survivin and COX-2 are respectively 71.83% and 77.47% in NSCLC tissue, all significantly higher than that of benign lesion tissue (19.05％ and 14.29%). There are significant correlations between Survivin expression and TNM stages of  patients, and the expression of COX-2 and histologic subtype.②There is a positive correlation between Survivin and COX-2 in NSCLC tissue. Conclusion: Survivin and COX-2 participate in the occurance and development of NSCLC through coordination between them.

    Key words  Survivin;COX-2;Non-small-cell lung cancer;Tissue microarray

    研究发现，凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展，是恶性肿瘤形成的重要机制之一。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子［１］,具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用。近十余年来，人们发现以阿司匹林为代表的非甾体类抗炎药在肿瘤的预防与治疗中具有明显的作用，其可能机制之一是通过抑制环氧化酶(COX)，使前列腺素类物质生成减少。研究发现COX-2在正常组织细胞中多不表达或低表达，但在多种肿瘤组织及细胞系中COX-2异常高表达。本研究旨在探讨Survivin与COX-2在NSCLC中的表达情况、与临床病理特征的关系，及其它们相互间的关系，期望证明Survivin与COX-2相互协同，共同参与肺癌发生发展，并且可能影响肺癌患者的预后。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  研究对象：收集选择青岛市市立医院胸外科2004年1月～2005年10月间手术切除非小细胞肺癌标本73例（术前均未行放、化疗）及肺良性疾病21例作为组织对照，所有标本均经病理检查证实并取自病变的典型区域。其中NSCLC病理组织学诊断及分级采用WHO 1999年肺癌组织学分类、分级标准［２］，分期采用1997年国际抗癌联盟(UICC)制定的肺癌临床分期标准［３］。所有标本均及时经10％中性福尔马林固定，熔点为56 ℃～58 ℃的石蜡包埋。

  1.1.2  研究材料：兔抗人Survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司，鼠抗人COX-2单克隆抗体、PV9000通用型免疫组化检测试剂盒、非免疫小鼠 IgG、非免疫兔 IgG均购自北京中杉公司。每批实验均分别取Survivin、COX-2阳性片作阳性对照，并分别用同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。

    1.2  方法

    1.2.1  组织芯片的制作：①观察每一组织标本的HE 切片以确定蜡块穿刺位置；②用 Beecher Instruments生产的组织芯片仪,从蜡块标记部位逐个取出2　mm组织芯,随即推入受体蜡块上已打好的孔内,制作成组织芯片蜡块；③将制作好的组织芯片蜡块面向下置于模具中，60　℃烤箱中放置1　h，使蜡块重新熔为一体。随后将蜡块连同模具一同取出，静置自然冷却至室温，然后置于-4　℃冰箱中7　min，将蜡块与模具剥离；④将制作好的组织芯片蜡块3 μm～4 μm连续切片，冷水漂片，挑选组织芯完整的切片转移至56 ℃水中展片，用预先制备好的APES载玻片捞片。

    1.2.2  组织芯片免疫组化标记：主要步骤为:①组织芯片切片常规脱蜡至水；②内源性过氧化物酶阻断；③组织微波抗原修复；④滴加适当稀释的一抗（Survivin：1∶80；COX-2：1∶600），湿盒内冰箱中4　℃过夜；⑤分别滴加试剂1、试剂2，均在湿盒内37　℃孵育20　min；⑥DAB显色,苏木素复染，脱水,透明，封片。

    1.3  结果判定

    Survivin、COX-2免疫组化染色结果判断标准采用Kawaski［４］阳性细胞半定量积分法：光镜下分析，在排除非特异性染色的前提下，A 以切片中阳性细胞染色深浅评分，淡黄色为1分，黄色为 2分，棕黄色为 3分；B 以切片中阳性细胞比例评分，随机计数5个高倍镜视野，阳性细胞数<5％为 0分，6％～25％为 1分，26％～50%为 2分，51％～75％为 3分，>75％为4分；两积分相乘，0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（＋）,5分～8分为中等阳性（），9分～12分为强阳性（）。COX-2评分略改动，只记为阴性与阳性，乘积<1分为阴性，其余均为阳性。

    1.4  统计学分析

    应用SPSS软件包11.5进行数据处理，以P<0.05确定差异有显著意义。

    2  结果

    2.1  组织芯片的质量

    本研究制成2个组织芯片蜡块，蜡块完整，肉眼可见组织芯排列整齐，外形为圆形或类圆形，无缺损现象。芯片HE染色结果：点阵分布均匀，组织芯完整，只有2例组织芯缺失不全，1例组织芯出现移位，为统计方便取有效例数92例（其中NSCLC组71例、对照组21例），有效率为97.87%,仍可代表原样本信息，不影响统计学分析。71例NSCLC病例中男性53例，女性18例；年龄38岁～81岁，平均年龄62.3岁；鳞状细胞癌 38例,腺癌31例，巨细胞癌2例；发生淋巴结转移33例；Ⅰ期36例，Ⅱ期23例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例。

    2.2.  Survivin、COX-2在两组组织中的表达及与NSCLC患者临床病理特征的关系

    Survivin蛋白表达阳性染色主要定位于胞浆，为粗细不一的棕黄色颗粒，部分病例可呈胞浆和胞核表达。COX-2蛋白阳性染色主要定位于胞浆，为清晰棕黄色弥漫性分布,强阳性组可见明显的颗粒状着色。Survivin、COX-2在两组组织中的阳性表达率及与NSCLC患者临床病理特征的关系见表1、表2。表1  NSCLC、非肿瘤性病变肺组织中Survivin、COX-2的表达表2  NSCLC中Survivin、COX-2的表达与临床病理特征的关系 注：＃：P<0.05

    2.3.  NSCLC组中Survivin与COX-2的关系（见表3）表3  Survivin与COX-2在NSCLC组织中表达的相互关系注：由于Survivin表达情况较少，故与合并计数

  表3经列联表卡方检验，Survivin与COX-2表达密切相关（P<0.05）。

    3  讨论

    Survivin基因于1997年首先由Ambrosini等［５］发现，其位于染色体17q25距端粒约3％的位置，全长14 796 bp,含有4个外显子和3个内含子，其编码产生由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量为16.5 KD。 Survivin在正常组织中，除胎盘、胸腺、生殖腺组织有微弱的表达外，其它分化成熟组织中都检测不到，但是Survivin在多种肿瘤中有表达。Monzo等［６］率先应用RT-PCR法检测非小细胞肺癌组织中Survivin mRNA的表达，发现85%肿瘤标本有Survivin表达，而在正常肺组织表达仅12%。我们的实验结果显示Survivin蛋白在NSCLC中高表达，阳性率为71.83％。鉴于Survivin基因在不同发育时期的胚胎组织中广泛表达，推测肿瘤细胞中Survivin基因的重新表达可能与获得的某种异常抗凋亡能力有关。Survivin通过抑制癌细胞凋亡，直接促进细胞逃离生长监控，使得细胞存活期延长、死亡率下降，表现出一定的生长优势，表明Survivin对肺癌的发生发展起着促进作用。此外，本实验结果显示Survivin阳性表达仅与患者临床分期相关，Survivin在Ⅲ期～Ⅳ期NSCLC患者中的阳性表达率显著高于Ⅰ期～Ⅱ期患者，TNM分期愈晚，Survivin阳性表达率越高，这表明Survivin的阳性表达预示肿瘤有较高的侵袭性和不良预后。

    环氧化酶(COX)是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，其中COX-2亚型为可诱生型,在正常生理状态下多数组织内检测不到,当细胞受到细胞因子、生长因子、炎症介质、促癌剂及一些癌基因产物等刺激后表达增加。1998年Hida［７］首先采用免疫组织化学方法研究COX-2在肺癌中的表达并初步探讨了COX-2表达与临床病理类型等方面的关系，表明COX-2主要参与非小细胞肺癌尤其肺腺癌的发生、发展。本实验发现COX-2在NSCLC组织中阳性表达显著高于非肿瘤性病变肺组织，此外在组织切片中观察到，肺癌组织中分布的部分增生腺体也可见COX-2高表达，而在正常肺组织内的腺体少有表达，因此认为COX-2与肺癌的发生发展密切相关。目前国内外报道肺癌组织中COX-2的表达与淋巴结转移及TNM分期关系的结果尚不一致，虽然本实验中未发现COX-2的表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关，但这并不足以否定其参与肺癌的浸润转移。有研究发现,COX-2过表达时细胞对基质的粘附性增加,E-钙粘连素水平下降,提示COX-2过表达与肿瘤细胞的局部浸润有关。Kozaki等［８］用高转移肺癌细胞系实验显示,COX-2表达与肿瘤侵袭转移能力呈正相关,其抑制物可减少远处转移，同时还观察到转移肺癌细胞内多种炎性介质及促血管生成物质增加，认为肺癌细胞可能在转移过程中利用COX-2参与炎症过程，类似炎症细胞穿越血管壁,从而促进肺癌血行转移。本实验中COX-2在肺腺癌组织中的阳性表达率较其在肺鳞癌组织中的高，差异具有显著性。我们的研究中发现COX-2表达与淋巴结转移无关,但在肺腺癌组织中显著高表达,表明COX-2的高表达可能在肺腺癌的早期即已发挥促进癌细胞血行转移的作用,而未参与淋巴转移途径,这与肺腺癌血行转移较早而淋巴转移较晚的临床特点相一致。

    COX-2在正常组织中不表达或低表达，在细胞受到各种刺激后迅速合成，这个表达特征类似于Survivin。多项研究发现多种肿瘤组织中表达上调的COX-2与增强的抗凋亡能力相关。Tsujii等［９］发现上皮细胞中过度表达COX-2将导致bcl-2水平升高,并可抑制丁盐酸诱导的凋亡。Sheng等发现COX-2的主要产物PGF2直接引起人结肠癌细胞的bcl-2的表达水平升高［１０］,而选择性COX-2抑制剂可下调bcl-2的水平并诱导细胞凋亡［９］。国内外研究发现Survivin表达与bcl-2密切相关，两者都是由无TATA的富含GC启动子调节的，转录激活均增强细胞的增殖。本实验结果发现NSCLC组织中Survivin与 COX-2表达正相关（χ２＝8.047,P<0.05），这初步表明两者具有协同作用，共同参与肺癌的发生发展。我们推测Survivin、bcl-2 与COX-2等可能由共同的转录激活机制，构成一个多基因共同作用并基于半胱天冬氨酸酶活性激发水平的平台，在肺癌的发生发展中起重要作用，但其具体机制有待于深入研究。

【参考文献】  ［１］ Shankar SL,Mani S,O,Guin KN,et al.Survivin inhibitor induces human tumor cell death through caspase-independent and dependent pathways ［Ｊ］.J.Nearoche,2001,92(2):426～436.

［２］ Travis WD,Colby TV,Corrin B,et al.WHO histological typing of lung and pleural tumors.3rd　ed.Berlin:Springer-Verlag,1999.

［３］ Mountain CF.Revisions in the international system for staging lung cancer.Chest,1997,111:1　710～1　717.

［４］ Kim YB,Kim GE,Pyo HR,et al.Differential cyclooxygenase-2 expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the uterine cervix［Ｊ］.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2004, 60(3):822～829.

［５］ Ambrosini G,Adida C,Altieri DC,et al.A novel anti-apoptosis gene Survivin,expressed in cancer and lymphoma［Ｊ］.Nature Med, 1997,3(8):917～921.

［６］ Monzo M,Rosell R,Felip E,et al.A novel anti-apoptosis gene:Re-expression of Survivin messenger　RNA as a prognosis marker in non-small-cell lung cancers［Ｊ］.J Clin Oncol,1999, 17(7):2　100～2　104.

［７］ Hida T, Yatabe Y, Achiwa H,et al.Increased expression of cyclooxygenase2 occurs frequently in human lung cancers,specially in adenocarcinomas ［Ｊ］.Cancer Res, 1998,58(17): 3　761～3　764.

［８］ Kozaki K, Koshikawa K, Tatematsu Y,et al.Multi-faceted analyses of a highly metastatic human lung cancer cell line NCI-H460-LNM35 suggest mimicty of inflammatory cells in metastasis ［Ｊ］.Oncogene,2001, 20(31):4　228～4　234.

［９］ Tsujii M,DuBois RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2［Ｊ］.Cell, 1995, 83(3):493～501.

［１０］ Sheng H,Shao J,Morrow,JD,et al.Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prosta glandin E2 in human colon cancer cells［Ｊ］.Cancer Res, 1998, 58 (16):362～366.