胸腹水脱落细胞流式细胞法DNA倍体分析的临床诊断价值

作者:李乐,伍严安,黄源茂

    【关键词】  胸腔积液,恶性；,DNA；,倍体；,胸部肿瘤；,流式细胞术

　　摘要:  目的  探讨胸腹水脱落细胞流式细胞法DNA倍体分析对诊断良恶性胸腹水的临床价值。  方法  应用流式细胞仪（FCM）对84例患者（恶性肿瘤组35例，非恶性肿瘤组49例）的胸腹水脱落细胞进行DNA倍体分析；以检出异倍体为恶性肿瘤判断标准，并与胸腹水常规脱落细胞学涂片检查结果比较。  结果  （1）恶性肿瘤组25例检出异倍体，阳性检出率为71.4%；常规细胞学法20例检出癌细胞，阳性检出率为57.1%；FCM法与细胞学检查法联合检测28例阳性，检出率为80%。（2）在恶性肿瘤组的25例异倍体中，17例病理检查检出癌细胞，8例未检出；而在20例常规细胞学检出癌细胞的患者中，3例DNA倍体分析无异常。（3）非恶性肿瘤组8例DNA表现为异倍体峰，但病理检查示间皮细胞活跃增殖，或未检出癌细胞。  结论  FCM法的灵敏度较脱落细胞法高，但2种方法的检测结果存在一定的差异；FCMDNA倍体分析在良恶性胸腹水的鉴别诊断上尤其当临床高度可疑而病理无法定性时，可作为诊断的重要参考与补充。

　　关键词:  胸腔积液，恶性； DNA； 倍体； 胸部肿瘤； 流式细胞术

　　胸腹水是胸腹腔脏器病变常见的临床表现，其产生机制十分复杂，准确快速地判定其良恶性对疾病的诊断、治疗有重要意义；有的疾病有时仅以胸、腹水为首发唯一症状，给临床鉴别诊断带来许多困难。传统的判断方法主要依靠胸腹水的常规脱落细胞学检查和生化指标检测，这些方法易受主客观因素影响，检出率较低。流式细胞术（FCM）具有对流动状态下的细胞进行快速大量、多参数分析的特点，在肿瘤研究方面的应用越来越广。笔者应用FCM对84例患者的胸腹水脱落细胞进行DNA倍体分析，并与胸腹水常规脱落细胞学涂片检查结果比较，探讨DNA倍体分析对良恶性胸腹水的鉴别诊断价值。

　　1  临床资料

　　1.1  一般资料  84例中，男性50例，女性34例，年龄（53,2±15.7）岁（21～99岁），均经临床诊断和病理细胞学检查确诊，并经X线检查、CT、MRI证实。84例患者分为2组：（1）恶性肿瘤组（n=35）：肺癌19例，胃癌5例，肝癌4例，胰腺癌2例，卵巢癌2例，胆囊癌、附睾腺癌、胸腺癌各1例。（2）非恶性肿瘤组（n=49）：结核性胸膜炎17例，肝硬化15例，肺梗死6例，脓胸4例，慢性胃炎3例，心功能衰竭2例，外伤2例。

　　1.2  方法  （1）将新鲜胸水或腹水1000 r/min离心10 min，收集脱落细胞，用pH 7.4、浓度0.01 mol/L的PBS洗涤2次，将悬液的细胞数调整为106 mL1，备用。取上述悬液100 μL在DNAPre样品自动制备仪（美国BeckmanCounter公司）上完成破膜、PI染色和固定等步骤，放置30 min后，用300目的滤网过滤除去细胞团块和凝固块，备用。（2）DNA倍体分析：FCM（EPICS XL 型，美国BeckmanCounter公司）检测染色处理后的悬液，每例测定10 000个细胞，数据分析采用MCYCLE细胞周期分析软件，并以健康人外周血淋巴细胞作为正常二倍体标准对照。（3）常规脱落细胞学涂片检查：结果判断以病理科细胞学检查报告为准。（4）DNA异倍体的判断。根据文献[13]制定FCM诊断瘤细胞的标准如下：①在正常二倍体G0/G1峰以外出现另一G0/G1峰作为标准，并且其DNA指数（DI=样品细胞G0/G1峰道值/标准细胞G0/G1峰道值）>1.10或<0.90，且有相应的G2M峰出现。②若直方图中仅出现单一G0/G1峰，则要求细胞周期中G2M期的细胞数>2.5%细胞总数；G0/G1峰的CV比值超过正常的CV比值的平均值两倍的标准差。③G0/G1峰明显不对称。④若直方图中二倍体细胞干系的增殖细胞数>10%细胞总数，即S期>10%，则定义为异倍体出现。

　　2  结果

　　2.1  DNA倍体分析  FCM分析健康人外周血淋巴细胞获得的正常细胞周期，其DNA含量直方图分为G0/G1期、S期、G2M期3个细胞峰，G0/G1、G2M细胞峰DNA的含量呈正态分布，S期细胞峰是一个加宽的正态分布（图1）。依据DNA异倍体的判断标准认为图B～E有异倍体出现，图F带有一个并非为异倍体的“肩”峰。       

　　A：正常细胞周期；B：正常二倍体峰外出现第二峰，C：S期>10％，D：G0/G1峰明显不对称，E：G2M>2.5％；F：G0/G1峰带有一个“肩”.  　　图1  胸腹水脱落细胞的FCMDNA分析（略）    　　Fig 1  FCMDNA ploid analysis for the exfoliated cell 

　　2.2  恶性肿瘤组25例检出异倍体，阳性检出率为71.4%；而常规细胞学法20例检出癌细胞，阳性检出率为57.1%。非肿瘤组中8例胸腹水细胞DNA表现为异倍体峰，但病理细胞学检查为间皮细胞的活跃增殖（图2A）；FCM术的灵敏度较高，病理细胞法特异性较FCM法高，但2种方法的检测结果存在一定的差异，2种方法的诊断指数均>1，在鉴别良恶性胸腹水时有重要参考价值（表1）。

　　2.3  在恶性肿瘤组FCM与细胞学联合检测28例阳性，检出率80%；25例异倍体中，17例病理细胞学检出癌细胞，8例未检出癌细胞，另有3例患者DNA倍体分析无异常而病理细胞学检出癌细胞（图2B）。2种方法检测结果总符合率68.6%，2种方法比较无统计学意义（配对四格表资料的χ2检验，P>0.05，表2）。

　　表1  2组FCMDNA倍体分析法与病理细胞学法的结果比较（略）

　　Tab 1  The comparison of the results with two methods[3]

　　n=84.  表中数据为例数（%）.  与非恶性肿瘤组比较,☆:P<0.01.

　　A：间皮细胞活跃增殖;B：检出癌细胞.

　　图2  胸腹水脱落细胞涂片(Wright  ×100)（略）

　　Fig 2  The exfoliated cell of hydrothorax and ascites (Wright  ×100)

　　表2  恶性肿瘤组FCMDNA倍体分析法与病理细胞学法检测比较（略）

　　Tab 2  The comparison of the results with two methods in malignant tumor group

　　表中数据为例数.

　　3  讨论    　　良恶性胸腹水的鉴别诊断在临床上始终是一个较为棘手的问题。胸腹水脱落细胞学检查是恶性胸腹水确诊强有力的证据，但因制片质量或诊断经验等原因可造成一定的漏诊、误诊，阳性率约为60%左右[4]。FCM可以进行细胞周期分析，为肿瘤的临床诊断和治疗提供帮助。正常人静止体细胞为二倍体，在增殖过程中存在不同的DNA含量，在细胞周期的各个时期，DNA含量呈周期性变化，整个复制周期可以描述为G0/G1期、S期、G2M期，通过核酸染料标记DNA，并由FCM进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算G0/G1%、S%和G2M%，了解细胞的增殖能力。肿瘤的发生是从DNA的损伤开始的，恶性肿瘤细胞形成的一个特征是染色体畸形,包括染色体的整倍数或非整倍数复制[5],肿瘤细胞出现染色体数目及结构的异常致使G0/G1期细胞DNA含量增加、异倍体表现为DI值增大或S期、G2M期细胞比例增高等反映细胞增殖活性的指标发生变化。因此，对胸腹水脱落细胞DNA倍体分析可以反映细胞的异质性，在鉴别良恶性胸腹水的诊断方面有重要意义。

　本研究FCMDNA倍体分析法灵敏度为71.4%，略高于Saha等报道[6]。本研究2种方法的检测结果总符合率为68.6%，低于方国安等报道[7]，这与DNA异倍体阳性的判断标准不同有关。FCM与细胞学联合检测阳性检出率为80%，提示多种方法联合检测有助于提高阳性检出率。    　　FCMDNA倍体分析法在鉴别胸腹水性质方面与病理细胞形态学的诊断不同，它代表的只是DNA含量的异常，因此就出现了与病理细胞学诊断不相符的情况。如在恶性肿瘤组中，25例胸腹水细胞表现为异倍体，病理细胞学检查仅17例检出癌细胞，8例未检出癌细胞，这可能与FCM的高灵敏度有关。FCM单次分析的细胞数量多，少量的异倍体细胞即可在细胞周期直方图上表现出来。另有3例病理细胞学检查可见瘤细胞而DNA倍体分析无异常的假阴性情况，考虑其原因有：（1）肿瘤可能是二倍体肿瘤；（2）胸腹水中异倍体肿瘤细胞数量极少时，直方图上肿瘤细胞的异倍体峰可被正常二倍体细胞如白细胞、间皮细胞所掩盖；（3）某些肿瘤细胞同时存在染色体缺失和染色体复制，DNA净含量未发生改变，异倍体无法检出。本研究8例非肿瘤组中的胸腹水脱落细胞DNA倍体分析显示异倍体为假阳性，考虑其原因有：（1）在标本制备程序过程中导致细胞损伤所致；（2）排除间皮细胞的活跃增殖影响检测结果，应考虑是否由于DNA含量变化发生在细胞恶性形态变化之前（如癌前病变）。    　　笔者认为，FCMDNA倍体分析以其快速、灵敏、精确、细胞分析量大等优点可应用于良恶性胸腹水的鉴别诊断，尤其当临床高度可疑而病理无法定性时，对明确诊断有重要参考价值；胸腹水脱落细胞DNA倍体分析若出现异倍体峰、细胞DI值增大或S期、G2M期细胞比例增高，均高度提示恶性腹水的可能。DNA倍体分析法可作为病理细胞学诊断的补充。

　　参考文献：　　　　[1]  王  强,吴清明,童  强,等. DNA倍体分析联合端粒酶活性检测对良恶性腹水的鉴别诊断价值[J]. 中国误诊学杂志, 2005,5（14):26032605.

　　[2]  Stonesife K J,Xiang J,Wilkinson E J,et al. Flow cytometric analysis and cytopathology of body cavity fluids[J]. Acta Cytol, 1987,3(2):125130.

　　[3]  Fuhr J E,Kaltine A A,Sullivan T A,et al. Flow cytometric analysis of pulmonary fluids and cells for the detection of malignancies[J]. Am J Pathol, 1992,141(1):211215.

　　[4]  American Thoracic Society. Management of malignant pleural effusion[J]. Am J Resprir Crit Care Med, 2000,162（7）:1987.

　　[5]  马正中,阐  秀,刘树范. 诊断细胞病理学[M]. 郑州:河南科学技术出版社, 2000:866869.

　　[6]  Saha I,Dey P,Vhora H,et al. Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid[J]. Diag Cytopathol, 2000,22(2):8185. 　　[7]  方国安,金秀国,刘  波,等. FCM检测胸腹水脱落细胞DNA含量的探讨[J]. 上海医学检验杂志, 1999,14(6):360361.

　　作者单位: 福建医科大学 省立临床学院、福建省立医院 检验科，福州  350001