心肌梗死后骨髓间充质干细胞治疗改进心功能及心肺复苏结果的研究

作者:王彤,黄子通,符岳,方向韶

作者单位：中山大学附属第二医院急诊科， 广东 广州 510120           【摘要】  【目的】　探索大鼠心肌梗死并经骨髓间充质干细胞（MSC）治疗后，心功能的变化及对其后进行的心肺复苏结果的影响。【方法】　18只雄性 Sprague-Dawley大鼠，随机分为两组，MSC 注射组和磷酸缓冲液（PBS）注射组，每组9只大鼠。先开胸结扎左前降支冠状动脉，4周后再次开胸接受PKH26荧光标记的悬浮在PBS中的5×106 MSC或仅用PBS梗死部位注射治疗，注射后2周及4周用超声心动图测量射血分数，4周时诱导心室颤动及进行心肺复苏，测量心肺复苏前及心肺复苏后4 h内的血液动力学参数的变化。并在心肺复苏72 h 后取心肌组织进行病理切片检查。【结果】　与注射磷酸缓冲液相比，注射MSC 2周（67%±4% vs 56%±5%，P＜ 0.001）及4周后（67%±6% vs 53±13%，P＜ 0.01）射血分数明显提高，心肺复苏前后的血液动力学参数包括心脏指数、dp/dt40、-dp/dt、左心室舒张末期压明显改善；虽然2组的复苏成功率没有明显区别，但72 h生存率2组比较有明显差异（58.6±20.6 vs 26.1±21.6，P＜ 0.05）。心肌组织病理切片发现有大量的PKH26标记的细胞存在。【结论】　心肌梗死后MSC治疗能明显改善心功能，同时也能明显改善心肺复苏前后的血流动力学参数及72 h生存时间。

    【关键词】  骨髓间充质干细胞； 心室颤动； 心跳骤停； 心肺复苏； 心肌梗死； 射血分数； 心功能

    Myocardial Function and Outcome of Cardiopulmonary Resuscitation in a Rat Model of

    Myocardial Infarction Treated with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

    WANG Tong， HUANG Zi-tong， FU Yue， FANG Xiang-shao

    （ Department of Emergency，The Second Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University，Guangzhou 510120, China ）

    Abstract: 【Objective】 To investigate myocardial function and outcome of cardiopulmonary resuscitation (CPR) in a rat model of myocardial infarction treated with bone marrow mesenchymal stem cells. 【Methods】 A thoracotomy was performed in 18 rats. Myocardial ischemia was induced by ligation of the left anterior descending artery (LAD). 4 weeks later, animals were randomized to receive 5×106 MSCs marked with PKH26 in phosphate buffer solution (PBS) or PBS alone as a placebo. Four weeks after MSCs or PBS injection, ventricular fibrillation (VF) and CPR were performed. Ejection fraction (EF) was quantitated two and four weeks after administrating MSCs or PBS. Hemodynamics, including cardiac index （CI）, dp/dt40, –dp/dt, and LVDP were measured before inducing VF and hourly following return of spontaneous circulation (ROSC). MSCs were counted in 5 ?滋m sections obtained from each harvested heart with cryostat. 【Results】 Significant improvements in EF, CI，dp/dt40，-dp/dt，LVDP followed injection of MSCs prior to inducing VF. Following ROSC, myocardial function and hemodynamic were significantly greater in animals treated with MSCs. Duration of survival were significantly longer in MSCs-treated animals compared PBS-treated animals. 【Conclusion】 Myocardial function before and after CPR and survival time after CPR were significantly improved in animals treated with MSCs compared to those which received PBS.

    Key Words: bone marrow mesenchymal stem cells; ventricular fibrillation; cardiac arrest; cardiopulmonary resuscitation; myocardial infarction; ejection fraction; myocardial function

    [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（5）:529-534]

    近几年来，细胞治疗学的发展非常迅猛，利用细胞移植的方法来增加有功能的心肌细胞的数量，从而改善心功能已成为心血管疾病治疗的新途径 [1，2]。以前的心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）研究使用的均是健康的动物，且研究的重点放在复苏后药物的选择及各种器械如何改进复苏后血流动力学[3，4]。但临床实际情况是在CPR发生之前病人大多有严重的心脏疾病[5]，因而本课题研究力图尽量接近临床实际，首先结扎左冠状动脉前降支（left anterior desending artery，LAD），造成较严重的心肌缺血及缺血后心功能不全，4周后注射骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCS）或磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），治疗的干预措施提到了CPR之前，治疗4周后再诱发心室颤动（ventricular fibrillation，VF）及进行CPR，观察心肌梗死后MSCS治疗对大鼠心功能及CPR前后血流动力学的影响，从而为MSCS治疗心肌缺血及改善CPR的结果提供实验依据。本研究不仅探讨MSCS改善心肌梗死后心功能不全，而且是首次探讨心肌梗死后MSCS治疗对其后发生的心跳骤停和心肺复苏的血流动力学及生存时间的影响。

    1   材料与方法

    1.1   实验动物和细胞

    成年Sprague-dawley雄性大鼠，6～8个月大小，体质量450～550 g。

    P3代经PKH26（美国Sigma Aldrich公司）染色的MSC。

    1.2   主要仪器及材料

    红外线CO2监测仪（型号IL200，美国Instrumentation Laboratory公司），小动物呼吸机（型号3500H，美国Sechrist公司），惠普超声心动图机（型号2406A，美国Hewlett-Packrad公司），除颤仪（型号Smart，美国Philips公司），监护仪（型号7010，美国Tram公司），CODAS 数据采集系统（美国DataQ公司），高敏压力转换器（型号42584-01，美国Abbott Critical Care Systems公司）。PE-50的塑料导管 (Intramedic PE-50, 美国Becton-Dickinson公司)，4-F 塑料导管 (model C-PMS-401J, 美国Cook Critical Care公司)。

1．3   实验方法

    1．3．1   大鼠骨髓MSC的分离、培养、传代、鉴定、染色   取1月龄Sprague-Dawley大鼠，在无菌条件下小心取出双侧股骨和胫骨，加入10 mL DMEM 完全培养液，无菌注射器反复冲洗骨髓腔，将冲洗后制成的细胞悬液，600×g离心5 min，重新加入L-DMEM完全培养液10 mL悬浮细胞后，移入25 cm2塑料培养瓶中，二氧化碳培养箱中37 ℃恒温原代培养（P0）。以后每3 d更换一次完全培养液。当细胞附壁生长至整个底层瓶壁的90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化后按1 ∶ 2比例传代（为P1代）。倒置显微镜逐日观察，重复上述操作，并记为P2、P3代。P3的细胞将用于所有的动物实验。

    取生长良好的P3代细胞，加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤3次，加入荧光标记抗体，4 ℃孵育30 min，PBS洗去未标记抗体，1%多聚甲醛固定15 min，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记CD11b/c，CD29，CD44H，CD45，CD90.1。

    取生长良好且已长满瓶底的P3代细胞（细胞总量为1×107个），加入胰蛋白酶消化，600×g离心5 min后，用PBS洗涤一次，再600×g离心10 min，用移液枪将PBS吸除干净（剩余量＜ 25 mL），加入PKH26细胞专用液体0.5 mL，制成细胞悬液，迅速加入预先已准备好的已加入1μL荧光物质的PKH26细胞专用液体0.5 mL中，混合孵育4 min，加入1%小牛血清蛋白1 mL，终止染色1 min，再加入完全培养液2 mL，600×g离心10min，去除上清，加入完全培养液10 mL悬浮细胞，更换新的离心管，洗涤细胞共3次，显微镜下观察染色效果。

    1．3．2   大鼠心肌缺血模型的制备   18只Sprague-Dawley大鼠随机分为实验组和对照组，每组9只动物。在手术的前晚禁食，但可自由进水。手术当天按45 mg/kg给予腹腔内注射喷妥巴比妥麻醉。将手术及电击部位的毛剃干净。用14 g的穿刺针套管作为气管导管插入，用线固定于嘴部皮肤，防止脱出。置一呼气末CO2探测导管于气管导管和呼吸机导管之间，用红外线CO2分析仪监测呼气末CO2分压（PETCO2）。调整呼吸机至工作状态，潮气量为6.5 mL/kg ，呼吸频率为100 次/分，FiO2=0.21。 使用非侵入性经胸壁超声心动图测量基础心功能后开始机械通气。从左侧第4肋间打开胸腔，暴露心脏。用镊子撕开心包膜，清楚暴露左前降支冠状动脉。用带5/0细尼龙丝线的小圆针缝扎左前降支冠状动脉（left anterior descending coronary artery，LAD）。 关胸前放入一细塑料软管，便于关胸后引流和吸取气体和渗出的血液。 LAD缝扎成功的标记是肢体心电图ST段明显抬高，QRS波宽大畸形。关胸后继续机械通气并严密观察EKG 和CO2波形1 h，如有VF发生，立即使用2焦的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。1 h后停止机械通气，拔除引流管，按160 mg/kg肌肉内注射抗菌素头孢唑啉及止痛药Ketorolac 0.4 mg/kg。 动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。

    1．4   实验过程

    动物模型制备成功4周后，动物重新麻醉。行气管插管并监测PETCO2。用无创超声心动图检查结扎LAD的心功能。随后该动物进行第2次开胸手术接受PKH26标记的5×106/0.1 mL MSC 或等量的PBS从梗死心肌局部注射。放置引流软管、关胸、注射抗菌素及止痛药均与模型制备阶段相同。

    注射MSC 或PBS 4周后， 动物被再次麻醉。行气管插管并PETCO2。游离右颈动脉， 用PE-50塑料导管插入到达左心室内, 利用高敏感性的压力传感器，用于测量左心室舒张末期压(LVDP)、左心室收缩压力上升到40 mmHg时的上升速率 (dP/dt40) 和左心室舒张末期压 (-dP/dt)。 游离右颈外静脉，用型号为 4-F 塑料导管插入，通过上腔静脉到达右心房，一根尖端导电的绝缘电极由该套管插入，直到由该电极所引出的心内膜心电图被记录，说明该导线已接触到了右心室心内膜，该电极用于诱导VF的发生。游离左颈外静脉，用PE-50塑料导管插入，通过上腔静脉到达右心房，利用同样高敏感性的传感器测量右房压（right atrium pressure，RA）。游离右股动脉，用一根带温度微探针的长10 cm直径0.5 mm导管(型号9030-12-D-34, 美国Columbus Instruments公司)插入，到达胸主动脉监测和记录中心血温，亦用于测量心脏指数。测量心脏指数，每一次用0.2 mL温度介于8～12 ℃的生理盐水，从该导管注入。心脏指数由专用的计算机及软件计算并记录 (型号CO-100, 美国Critical care medicine 研究所)。 游离左股动脉，用PE-50塑料导管插入，到达胸主动脉，利用同样高敏感性的传感器测量主动脉压。游离左股静脉，用PE-50塑料导管插入，到达下腔静脉，用于静脉血的抽取和回输血液。肢体导联Ⅱ心电图及PETCO2由CODAS计算机软件连续纪录。在整个实验过程中，用电热灯泡控制动物的体温在36.8 ℃ (±0.2%)。

    当上述手术过程完成以后，所有的基本参数包括：射血分数（ejection fraction，EF），心脏指数（cardiac index，CI），心律（heart rate，HR），平均动脉压（mean artery pressure，MAP），PETCO2，RA，LVDP均采集完毕。诱发VF之前15 min，开始机械通气，FiO2 为0.21，室颤之前5 min，采集动静脉血液标本用于血气分析。通过右心室心内膜电极，用 60 Hz 频率电流最大达到4 mA的电流诱发室颤。电流必须维持3 min，以防止大鼠自动转复为窦性心律。在诱发室颤成功后停止机械通气。在维持总共6 min的室颤后，开始进行6 min的胸外按压。在胸外按压开始后，恢复同步机械通气，胸外按压的频率为200次/分，机械通气的频率为100次/分，按压与通气的比例为2∶1。调整FiO2 至1.0。最理想的按压深度为维持冠状动脉灌注压在25±2 mmHg。经过6 min的机械通气和胸外按压, 开始总共3个循环，每个循环3次，每次2焦的体外电击除颤。每个循环的间期，继续胸外按压30 s，直到下一个循环或恢复窦性心律为止。自主循环恢复的标志为：有节律心律的恢复和主动脉平均动脉压维持在60 mmHg以上至少 5 min。  

    恢复自主循环以后继续观察4 h，并连续采集所有的参数 （CI，HR，MAP，PETCO2，RA，LVDP）。4 h后停止机械通气，拔除所有的导管，并缝合皮肤，碘酒酒精消毒伤口。动物稍清醒后，拔除气管插管。注射抗菌素及止痛药均与模型制备阶段相同。实验过程结束后，连续观察总共3 d，3 d内死亡的动物，立即开胸摘取整个心脏，3 d内存活的动物，在观察期满3 d之后，用过量的喷妥巴比妥腹腔内注射致其死亡，同样立即开胸摘取整个心脏。所有心脏标本立即放入液氮中冷冻保存用于病理切片。整个实验过程见图1。

  1．5   观察指标

    1．5．1   超声心动图   每个动物在结扎LAD前（基础值），结扎LAD 4周后（注射MSC或PBS前）、注射MSC或PBS后2周及4周共4个时间点采集数据。

    1．5．2   血液动力学指标的监测  主动脉压、左心室压、心电图、PETCO2被连续记录。DP/dt40和-dP/dt由CODAS 配套的统计学软件计算得出。血气标本在VF前，CPR后60 min及240 min 采集共3次。因血气分析导致的失血量由健康大鼠补回。

    1．5．3   细胞示踪   使用冰冻切片机(Micron HM 500 OM) 对每个心脏的结扎梗死部位进行连续切片。切片的厚度为5 μm，切片后立即放在荧光倒置显微镜下 (Olympus I×71) 观察并拍片。

    1．7   统计分析

    组间比较采用方差分析和Scheffe’s 多重比较。复苏成功率及72 h的生存率比较使用χ2检验。平均值用均数±标准差。确定P< 0.05 差异有显著性意义。

    2   结   果

    2．1   MSC的鉴定及标记

    流式细胞仪分析P3代培养细胞显示为高纯度的MSC。超过98% 的MSC CD29、CD44H、CD90.1为阳性，而少于6%的细胞CD11b/c、CD45 为阳性。极少量造血干细胞表面标记阳性的原因可能与所培养细胞含有极少量杂质细胞及流式细胞仪的检测偏差有关。PKH26标记后，超过95%的细胞被染色。

    2．2   超声心动图结果

    在结扎前，2组动物之间的EF没有显著性差异（表1）。LAD 结扎后4周，2组动物的EF 明显降低 (与结扎前的基础值相比P < 0.01；4周时2组比较没有统计学差异)。MSC与PBS治疗后2周（67 %±4% vs 56%±5%，P=0.0001）及4周（67%±6% vs 53%±13%，P=0.002）, MSC治疗组较治疗前比较及与对照组比较EF明显改善。

    2．3   血液动力学结果

    在MSC治疗之后4周诱发心跳骤停之前及CPR之后, 2组的MAP、HR、PETCO2以及血气分析的结果均没有显著差别。在CPR 之前, MSC治疗组其CI, dp/dt40, -dp/dt, LVDP 与对照组相比有显著性差异(P< 0.01)；在恢复自主循环以后的4 h内(60、120、180、240 min)，MSC组CI、dp/dt40、-dp/dt、LVDP 与对照组相比依然有显著性差异(P< 0.05，表2)。

    2．4   组间生存时间的比较

    CPR后2组自主循环恢复的比率没有明显差异 (表3)。虽然MSC治疗组其电击复律的次数要比对照组要少，但还没有达到统计学差异的程度。但CPR后72 h生存时间, MSC治疗组与其对照组相比有统计学差异。达72 h生存的动物数目, MSC治疗组要比对照组多, 但也没有统计学差异。

    2．5   病理结果

    病理切片的结果显示心肌内大量存在PKH26标记的MSC(图2)。

    3   讨   论

    在临床实际，绝大多数心跳骤停和心肺复苏的病例均存在有缺血性心脏病[5]。为了更接近临床心跳骤停和心肺复苏实际的情况，在我们的这个研究中，首先开胸结扎大鼠的左前将支冠状动脉诱导心肌缺血。4周后通过B超确认左心室功能已降低，所有的动物均随即分组接受MSC 或PBS注射。注射后2周及4周，所有MSC注射的动物其射血分数均明显得到改善。MSC注射组的血液动力学参数包括：CI, dp/dt40, -dp/dt,  LVDP，在心跳骤停前及CPR后的4 h内与PBS注射组比较有显著性差异。MSC注射组CPR后生存时间与PBS注射组相比较有显著性差异。

    3.1   选择有基础心血管疾病的动物作为心跳骤停及CPR模型的重要性

    本研究与之前所有的心肺复苏研究的区别在于，纵观所有发表的CPR文章中，所使用的基本都是健康的动物，这与临床的实际情况有很大的区别[5]。第2个不同点在于CPR研究的重点在于CPR后药物的选择及改善血流动力学设备的改进上[3]。CPR学界已经意识到这些问题的存在，并开始在这方面进行探索。Fang等人[5]的研究就使用了左冠状动脉结扎模型诱发心力衰竭后的动物进行心跳骤停及心肺复苏的研究，本研究就是在此基础上，对有基础疾病的动物进行干预，观察其能否改进CPR的效果。这为CPR的研究提供了一些有益的思路，使之更贴近临床的实际情况。

    3.2   治疗心血管疾病所致心肌细胞凋亡和死亡的理想“种子”细胞

    近年来心血管疾病的治疗进展非常迅速，包括受体阻滞剂及血管转换酶抑制剂的使用，冠状动脉搭桥术、血管内支架等手术和介入技术的应用，心血管疾病的患者的平均寿命有所延长、死亡率有所降低，但仍然有超过50%的病人在初次诊断为心力衰竭后的5年内死亡[6]。而引起如此高死亡率的根本原因在于有收缩功能的心肌细胞大量丧失[7]。虽然心脏本身具有一定的修复能力，包括体内心肌干细胞的动员和向心肌细胞演变[8]，心肌细胞本身的肥大，但仍然抵消不了心肌细胞大量丢失所导致的心功能下降。死亡的心肌区域被没有收缩功能的纤维斑痕组织所取代。而MSC能在体外和体内演变为心肌细胞，取代因各种原因而死亡的宿主心肌细胞，因而MSC作为一种新的治疗手段，正逐渐被用于心血管疾病治疗[9]。

    大量实验的和临床的研究证实，MSC移植能改善缺血性心脏病的心功能[10]。在Perin的研究[10]中注射MSC 2周后其心脏的电及机械功能有显著的改善。在另一个研究中，MSC注射能增加毛细血管的密度和改善收缩功能。

    3.3   MSC改善心功能及CPR后血流动力学结果及生存时间的可能机制

    MSC改善心功能及CPR结果的可能机制包括：①移植的MSC能在体内演变为心肌细胞，从而取代因各种原因而死亡的心肌细胞，从而恢复心功能。在一个关于MSC移植的研究中，MSC移植后4周，所移植的MSC已经有心肌细胞的特异性抗原表达，心肌肌钙蛋白T及肌间线蛋白阳性。尤其是所移植的MSC能表达连接蛋白-43，一种能促进心肌细胞闰盘连接的一种蛋白质[11]。故心功能的改善极有可能是MSC分化为心肌细胞的结果。②MSC移植能促进心脏新生血管的形成[12]。MSC既能分化为内皮细胞，也能分化为平滑肌细胞，而这两种细胞却是血管的主要组成成分。新生血管的形成是一个重要过程。由于血管的形成，能增加心肌血流的灌注，挽救因局部缺血而处于冬眠的心肌细胞, 从而减轻心室的扩张及改善心功能。③MSC移植保护和恢复细胞外基质的完整性。由于支持心肌细胞的细胞外基质的损坏，导致了心室的扩张[13]。有强烈的证据支持移植的MSC能分泌一些基质成分修复受损伤的宿主细胞外基质，从而恢复宿主心肌细胞的结构性支撑，限制梗死区域的扩大和改善梗死局部的收缩功能[14]。④ 旁分泌作用在MSC移植过程中可能起着非常重要的作用。MSC移植后能分泌大量的生长因子，细胞活素、化学趋化因子及其它的蛋白质。干细胞所分泌的这些蛋白质类物质对组织的修复具有不可估量的作用[1]。最新的研究显示，MSC至少分泌34种蛋白质，其中有9种蛋白质在5-杂氮胞苷的诱导下发生了明显的变化[15]。

尽管本研究中MSC注射组的复苏成功率比PBS对照组的复苏成功率要高，电击复律的次数比PBS对照组要低，但均没有统计学差异。其中的原因可能是结扎LAD后2个月可能还没有造成严重的心力衰竭；同时，心室颤动维持6 min，以及CPR持续6 min，可能还不足以造成非常严重的打击。但复苏后的72 h生存时间MSC治疗组与PBS对照组相比有显著性差异。这与我们预先的设想相吻合。

    最后，部分研究者报道应用干移植后，会发生心律失常等并发症[10，16]；但我们在整个研究过程中未发现有任何不良反应。

    我们的研究结果提示：MSC移植不仅改善了心肌梗死后的心功能，而且改善了CPR前后的血液动力学结果及延长了CPR后的生存时间，因而MSC可能成为心肌梗死治疗的潜在的重要治疗措施之一。

【参考文献】  PERIN E C. The use of stem cell therapy for cardiovascular disease [J]. Tex Heart Inst J, 2005, 32(3): 390-392.

WOLLERT K C, DREXLER H. Clinical applications of stem cells for the heart [J]. Circ Res, 2005, 96(2): 151-163.

WEIL M H, SUN S. Clinical review: Devices and drugs for cardiopulmonary resuscitation -- opportunities and restraints [J]. Crit Care, 2005,9 (3): 287-290.

EWY G A, KERN K B, SANDERS A B, et al. Cardiocerebral resuscitation for cardiac arrest [J]. Am J Med, 2006, 119 (1): 6-9.

FANG X, TANG W, SUN S, et al. Cardiopulmonary resuscitation in a rat model of chronic myocardial ischemia [J]. J Appl Physiol, 2006, 101(4): 1091-1096.

BELTRAMI A P,URBANEK K, KAJSTURA J, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction [J]. N Engl J Med, 2001, 344(23): 1750-1757.

JAIN M, PFISTER O, HAJJAR R J, et al. Mesenchymal stem cells in the infarcted heart [J]. Coronary Artery Dis, 2005, 16(2): 93-97.

VAN VLIET P, SLUIJTER J P, DOEVENDANS P A, et al. Isolation and expansion of resident cardiac progenitor cells [J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2007,5 (1): 33-43.

MINGUELL J J, ERICES A. Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2006, 231(1): 39-49.

PERIN E C. Stem cell therapy for cardiovascular disease [J]. Tex Heart Inst J,2006,33(2): 204-208.

NAGAYA N, KANGAWA K, ITOH T, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy [J]. Circulation, 2005, 112(8): 1128-1135.

DAI W, HALE S L, MARTIN B J，et al. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects [J]. Circulation, 2005, 112(2): 214-223.

FEDAK P W, SZMITKO P E, WEISEL R D, et al. Cell transplantation preserves matrix homeostasis: a novel paracrine mechanism [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2005, 130 (5): 1430-1439.

SAM J, ANGOULVANT D, FAZEL S, et al. Heart cell implantation after myocardial infarction [J]. Coron Artery Dis, 2005, 16(2): 85-91.

YE N S, CHEN J, LUO G A. Proteomic profiling of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine [J]. Stem Cells Dev, 2006, 15(5): 665-676.

韦育林，伍 卫，王景峰，等.骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征 [J].中山大学学报：医学科学版，2005，26(4):396-399.