低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新 生血管的影响

　　作者：董红燕,王强,张中明,袁延亮,张宜乾,徐　　作者单位：1.徐州医学院神经生物学研究中心，江苏徐州221002; 2.徐州医学院附属医院胸心外科，江苏徐州221002

　　国家自然科学基金(30672081)

　　【摘要】 目的 探讨动物整体水平下低氧反应元件(HRE)调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对促生血管的影响。方法 建立兔心肌缺血动物模型，实验分为转基因组、缺血对照组、载体对照组和假手术组。取缺血区心肌组织，检测心肌组织HIF-1α和hVEGF165表达，应用CD31及α-SMA免疫组化染色测定缺血心肌新生血管密度变化。结果 心肌缺血早期，伴随内源性HIF-1α表达增加，hVEGF165 mRNA及蛋白表达相继升高，缺血4～6周至高峰(P<0.01)，缺血12周，hVEGF165表达下调至缺血前水平。缺血12周，转基因组CD31(+)血管密度显著高于缺血对照组(P<0.01);但是，与缺血前相比，缺血12周， 转基因组α-SMA(+)血管密度显著低于缺血前水平(P<0.01)。结论 HIF-1α-HRE对缺血心肌转染hVEGF165表达发挥了有效的正相调控作用，有效地促进缺血心肌毛细血管生成。但hVEGF165作为促血管生成早期调节因子，其促生血管的结构尚不完整。

　　【关键词】 低氧反应元件;血管内皮生长因子;基因调控;心肌细胞;缺氧

　　本课题组前期研究结果表明，在细胞水平，低氧反应元件(HRE)对缺血心肌转染hVEGF165 基因表达发挥了良好的调控作用[1-2]。但是，在动物整体水平，HRE对缺血心肌转染hVEGF165基因长期调控行为对促血管再生的影响尚未阐明，本研究旨在动物整体水平，探讨在HRE调控下，缺血心肌转染hVEGF165基因表达对再生血管生成的影响，为提高缺血心脏hVEGF165 基因治疗的有效性及安全性提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 病毒包装及纯化

　　pAAV-9H-hVEGF165由美国加利福尼亚大学Prof. Su惠赠。pAAV-Helper、pAAV-RC由北京协和医院提供。病毒包装由本课题组前期工作完成[1]。将HEK293T细胞接种于9 cm平板，10 μg pAAV-9H-hVEGF165、10 μg pAAV-RC、15 μg pAAV-Helper、2.5 mol/L CaCl2 100 μl与去离子水混合至500 μl，加入500 μl 2HeBS，混匀后加入HEK293T细胞培养皿中，培养2～3天，将细胞从培养皿上刮下、离心，加入80 mmol /L MgCl2的PBS至细胞密度为107个/ml，加入DNA酶Ⅰ和RNA酶,离心，取上清加入粉剂PEG8000至终浓度10%;冰上置1 h，离心，25 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解沉淀。采用等体积氯仿抽提，离心，回收水相，-20℃保存、备用。

　　1.2 实验动物

　　成年新西兰大耳白兔，雌雄不限，体重2～2.5 kg，平均(2.3 ± 0.15)kg，共147只。由徐州医学院实验动物中心提供。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 心肌缺血动物模型制备

　　动物硫贲妥钠静脉麻醉，正中开胸，显露心脏。在左冠状动脉前降支上1/3交界处，6-0无损伤线缝扎，肉眼见结扎点下方左室前壁心肌渐变青紫、肿胀，同期监测ECG出现典型心肌缺血改变者，确认模型成功。

　　1.3.2 实验动物分组及处理

　　实验动物随机分为4组。转基因组(A组，n=42)：模型动物，心脏缺血区域分4点注射40 μl rAAV-9HRE-hVEGF165。缺血对照组(B组，n=42)：模型动物，心脏缺血区分4点注射40 μl 0.01 mmol/L PBS。载体对照组(C组，n=42)：模型动物，心脏缺血区分4点注射40 μl 9HRE-LacZ。假手术组(D组，n=21)：正常动物，仅开胸，游离左冠状动脉，未结扎。

　　4组动物分别于缺血前(0)及术后2、4、6、8、10、12周取材(A、B、C组每时间点6只，D组3只)。 麻醉后取动物心脏，取材组织分别采用液氮保存(Real time-RT-PCR及Western-blot检测)及10%中性甲醛固定(免疫组化)。于缺血12周时点，另取A和B组肝脏组织，液氮保存，待Western-blot检测。

　　1.3.3 心肌低氧诱导因子(HIF-1α)及hVEGF165mRNA表达检测

　　采用Real-time RT-PCR方法定量检测心肌组织HIF-1α及hVEGF165 cDNA片段。HIF-1α引物：HIF-1α-FP，5′-CATGCCCCAGATTCAAGATCA-3′;HIF-1α-RP，5′-TGGTAGGCTCAGGTGAACTCTGT-3′。hVEGF165引物，HIF-1α-FP ,5′ -CTACCTCCACCATGCCAAGTG -3′;HIF-1α-RP,5′-GCAGTAGCTGCGCTGATAGACA -3′。内参为β-actin。

　　取100 mg心肌组织，匀浆，离心，定量提取RNA。取10 μl总RNA，65℃ 10 min，离心15 s，在相应试管中分别加入20 μl HIF-1α反应体系或20 μl hVEGF165反应体系。完成PCR循环。将标准曲线样品和待测样品加入同一块96孔板中，采用7300 Real-time PCR仪(美国A&B公司)定量检测HIF-1α及hVEGF165 cDNA片段。

　　1.3.4 Western blot 测定HIF-1α、hVEGF165蛋白表达

　　每组取100 mg心肌组织，Lowry法测定蛋白浓度。 采用蛋白免疫印迹法，10%SDS-PAGE电泳，半干电转移30 min。分别加入hVEGF165 / HIF-1α一抗 (小鼠抗人VEGF165单克隆抗体，1∶250;小鼠抗兔HIF-1α单克隆抗体，1∶300)，二抗为羊抗小鼠IgG-AP(1∶100) ，NBT/BCIP显色，所得显色条带图象扫描，半定量分析。

　　1.3.5 缺血心肌血管密度测定

　　采用免疫组化(SP法)染色方法分别检测CD31及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达。石蜡切片，胰蛋白酶消化抗原修复。0.03%TritonX-100处理切片10 min，PBS冲洗，5%正常羊血清封闭;分别加入一抗(小鼠抗兔CD31抗体，1∶50;小鼠抗兔α-SMA抗体，1∶50)，4℃过夜;加入羊抗小鼠二抗(1∶200)，DAB显色。

　　应用HMIAS2000 型图像分析系统(武汉千屏影像公司)，观察CD31及α-SMA免疫组化染色阳性组织切片，以直径(短径)5～8 μm血管为毛细血管、直径(短径)15～50 μm血管为微动脉血管，进行图象分析，测定血管密度[3]。

　　1.4 统计学处理

　　资料以±s表示，采用单因素方差分析及q 检验进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 缺血心肌HIF-1α表达测定结果

　　转基因组和缺血对照组缺血心肌均可见内源性HIF-1α mRNA表达，其表达呈先增后减趋势。缺血2周，HIF-1α mRNA表达至峰值，而后逐渐降低。缺血12周，转基因组HIF-1α mRNA表达显著低于缺血对照组(P<0.01)(图1)。

　　心肌梗死后，各组HIF-1α 蛋白表达上调，显著高于缺血前水平(P<0.01)，缺血4周，HIF-1α 蛋白表达至峰值，此后HIF-1α 蛋白表达呈逐渐减少趋势。与缺血对照组比较，缺血10～12周，转基因组HIF-1α表达显著降低(P<0.05)(图2)。

　　2.2 缺血心肌hVEGF165表达测定结果

　　转基因组可见hVEGF165mRNA表达，其他各组均无表达。缺血4周，该组hVEGF165mRNA表达至峰值(P<0.01);缺血12周，转基因组hVEGF165mRNA表达显著降低，与缺血前水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

　　心肌缺血后，转基因组可见hVEGF165蛋白表达，其他各组均未见其表达。缺血2周，转基因组hVEGF165 蛋白表达明显高于其他各组 (P<0.01),缺血6周表达至高峰(P<0.01)， 随后，hVEGF165蛋白表达水平逐渐降低(图4)。

　　2.3 CD31(+)血管密度检测结果

　　结果显示，缺血2周，转基因组、缺血对照及载体对照组CD31(+)血管密度显著低于缺血前水平。而后，转基因组CD31(+)血管逐渐增加;缺血10～12周，与缺血前水平及缺血对照及载体对照组各相应时点相比，转基因组CD31(+)血管密度显著增加(P<0.01)(图5)。

　　2.4 α-SMA(+)血管密度检测结果

　　心肌缺血2周，各组α-SMA(+)血管密度均明显减少。缺血12周，转基因组α-SMA(+)血管密度显著低于缺血前水平(P<0.01)，且与缺血对照组及载体对照组相应时点相比，差异无统计学意义(图6)。

　　2.5 转基因安全性检测结果

　　Western-blot 测定结果显示，转基因组心肌组织可见hVEGF165蛋白高水平表达，而该组肝脏组织，以及缺血对照组心肌和肝脏组织中均未检测出hVEGF165蛋白(图7)。

　　3 讨 论

　　促血管生成转基因治疗可通过促进缺血组织血管新生，改善局部血供。研究显示，对于弥漫性缺血性心脏病而言，促血管生成转基因治疗具有良好的应用前景。血管内皮生长因子(VEGF)是一种低氧诱导性血管生长因子，具有氧相关性调控血管新生的作用。本课题组既往研究显示，将重组相关腺病毒(rAVV)携带hVEGF165基因转染缺血心肌中可产生明显的促血管生成作用[2]。

　　HIF-1α是由缺氧等因素诱导细胞产生的一种核蛋白。在病理条件下，低氧是活性HIF-1α的主要诱导因素[4-5]。低氧可通过减缓其降解，增加HIF-1α的稳定性及活性HIF-1α含量，后者可与HRE结合而诱导其下游多种基因的表达。本课题组前期在细胞水平的研究显示，将rAVV-9H- hVEGF165转染培养的心肌细胞，在变化的氧环境下，低氧相关性HIF-1α表达可通过与HRE结合，有效地调控心肌细胞转染hVEGF165基因的表达[1]。

　　本实验结果表明，在常氧状态下，兔内源性HIF-1α表达水平极低，而在心肌缺氧早期，HIF-1α表达迅速增加，通过与9HRE的结合，有效地调控转染hVEGF165的表达，随着后者促血管新生作用对缺血心肌局部血供的改善，在心肌缺血后期(第6～12周)，内源性HIF-1α表达逐渐降低。

　　分析HIF-1α和 hVEGF165两者变化的相互关系，不难看出，与缺血对照组相比，缺氧早期，随着HIF-1α的高表达，基因转染组hVEGF165 mRNA及VEGF蛋白表达分别在4周及6周达到高峰，显然，该时间段是转染hVEGF165发挥作用的最佳时间窗，从应用角度，该结果对确定hVEGF165基因治疗的有效时间点以及总体时间提供了有益的实验依据。随着缺血时间的延长，缺血心肌血管再生及局部缺氧的改善，HIF-1α表达降低，此间，在HRE的调控下，转染hVEGF165表达也随之下调。根据本研究结果，在动物整体水平，在缺血心肌变化的氧环境下，HIF-1α-9HRE 基因调控系统对hVEGF165产生了有效地正相调控作用，HRE作为hVEGF165的氧媒介基因“开关”，具有良好的灵敏性。

　　血管新生(angiogenesis)，是指芽生微小血管生成后，逐渐形成毛细血管和小肌性血管的过程。缺血心肌血管密度检测结果显示，缺血4周，转基因组心肌CD31(+)血管密度显著增高，由于hVEGF165蛋白消失的滞后性及招募血管内皮细胞的积累[6]，12周缺血末，转基因组CD31(+)血管密度仍处较高水平。分析显示，转基因组CD31(+)血管密度变化与hVEGF165表达趋势相一致。本实验还发现，缺血对照组心肌CD31(+)血管密度远低于转基因组，而载体对照组则无促血管新生的作用，这也排除了内源性HIF-1α表达及rAVV载体本身对缺血心肌血管生成结果的影响。

　　血管密度检测结果还显示，心肌缺血后，各组α-SMA(+)血管密度显著减少并维持在较低水平，显然，严重缺血导致了兔心肌血管平滑肌细胞的损伤。缺血12周，与CD31(+)血管密度变化趋势不同，转基因组心肌α-SMA(+)血管密度远低于缺血前水平，且与缺血对照组比较无差异。该结果表明，尽管hVEGF165可有效地促进CD31(+)血管内皮细胞增殖，但心肌α-SMA低水平表达的结果则提示，hVEGF165所诱生的毛细血管缺乏成熟血管α-SMA阳性肌细胞。从组织学角度分析，hVEGF165作为早期促血管生成调节因子所促生的新生血管较幼稚，组织结构尚不完整。为此，根据本研究结果，应当指出，在缺血心肌血管再生应用研究中，除应用血管生成早期调节因子hVEGF165之外，联合应用晚期血管生成调节因子，如Ang-Ⅰ、EPO等，促进新生血管结构的进一步重塑及成熟，对提高血管再生效果、改善缺血心脏功能具有重要的应用价值。

　　本研究结果还显示，转rAAV-9HRE-hVEGF165缺血心肌未见血管瘤形成，亦未在其肝脏组织检测出hVEGF165的表达。在本实验12周心肌缺血条件下，在动物整体水平， HRE作为hVEGF165的氧媒介基因“开关”具有良好的安全性。

　　尽管如此，由于实验观察时间的限制，HRE对缺血心肌转染外源性hVEGF165表达更长期的调控作用、对诱生血管功能的影响以及长期安全性，仍需进一步深入研究阐明。

　　【参考文献】

　　[1]张中明,姜波, 董红燕,等. 低氧反应元件对低氧复氧状态下心肌细胞转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用 [J]. 中华实验外科杂志,2005 ,22(12):1510-1512.

　　[2]董红燕，姜波，张中明,等. HRE对缺氧复氧心肌细胞转染hVEGF165基因表达的调控 [J]. 中华实验外科杂志,2008，25(8)：1095-1097.

　　[3]Poon RT,Ng IO, Lau C,et al. Tumor microvessel density as a predictor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma: a prospective study [J]. J Clin Oncol, 2002, 20(7):1775-1785.

　　[4]Henry TD, Annex BH, Mckendall GR, et al. The VIVA trail: vascular endothelial growth factor in ischemia for vascular angiogenesis [J]. Circulation, 2003, 107(10):1359-1365.

　　[5]Huang LE, Bunn HF. Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance [J].J Biol Chem, 2003, 278 (22):19575-19578.

　　[6]张宜乾，张中明，闫英群,等. 低氧反应元件调控下hVEGF165基因表达及其蛋白产物的延迟消失[J]. 生理学报,2006，58(3)：281-286.