Ａｎｇ-１／Ｔｉｅ２在大鼠体－肺分流肺动脉高压形成中的作用

　　作者：王伟,梁孟亚,张希,王治平　　作者单位：中山大学附属第一医院心脏外科， 广东 广州

　　【摘要】 目的】 探讨Ang-1及其受体Tie2在体-肺分流肺动脉高压形成过程中的作用。【方法】 分流组20只大鼠行左颈总动脉-左颈外静脉分流手术，对照组16只大鼠行假手术。分别于术后4周和8周测量右心室收缩压，并对大鼠肺组织进行组织学分析，测量肺微细动脉壁厚度指数。通过实时荧光定量RT-PCR和Western Blot的方法，检测大鼠肺组织中Ang-1和Tie2的表达。同时，通过Western Blot检测caspase-3及激活型caspase-3的表达。【结果】 与对照组相比，分流组大鼠术后第4周和第8周右心室收缩压明显升高。组织学分析发现，分流组大鼠肺微细动脉内膜内皮细胞增生肥大，血管壁厚度指数增加。在分流引起肺动脉高压形成的过程中，Ang-1和Tie2在mRNA及蛋白水平上均明显增加。与此同时，标志细胞调亡的激活型caspase-3的表达却明显下降。 【结论】 Ang-1和Tie2的表达与肺动脉高压紧密相关。Ang-1/Tie2系统可能通过抑制内皮细胞凋亡，促进体-肺分流肺动脉高压的形成。

　　【关键词】 血管生成素-1; Tie2; 肺动脉高压; 凋亡; caspase-3; 大鼠

　　Roles of Angiopoietin-1/Tie2 in Development of Shunt-inducedRat Pulmonary Arterial Hypertension　WANG Wei， LIANG Meng-ya， ZHANG Xi， WANG Zhi-ping*　Department of Cardiac Surgery， the First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China　Abstract：【Objective】 To elucidate possible roles of angiopoietin-1 and its receptor Tie2 in the development of shunt-induced pulmonary arterial hypertension. 【Methods】 Twenty Spargue-Dawley rats in shunt groups underwent left common carotid artery-external jugular vein shunt operation， and 16 rats in control groups received sham operation. At week 4 and 8 of the study， right ventricular systolic pressures were measured. Histologic analysis of lung tissue was performed and the percentages of vascular wall thickness of pulmonary arterioles were also measured. The expression of Ang-1 and Tie2 was investigated by real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot in the lung. The expression of caspase-3 and cleaved caspase-3 was also investigated by Western Blot. 【Results】 Compared with control groups， shunt induced significant increase in right ventricular systolic pressures at week 4 and 8. Histologic analysis of the lungs in shunt groups exhibited endothelial cell hypertrophy and proliferation in the intima of pulmonary arterioles along with increase of percentages of vascular wall thickness. During the development of shunt-induced pulmonary arterial hypertension， mRNA and protein expression of Ang-1 and Tie2 in the lung significantly increased. At the same time， the expression of cleaved caspase-3， a marker of apoptosis， significantly decreased.【Conclusion】 The expression of Ang-1 and Tie2 was tightly correlated to pulmonary arterial hypertension. Ang-1/Tie2 system may protect the pulmonary endothelium against apoptosis and promote the development of shunt-induced pulmonary arterial hypertension.

　　Key words： angiopoietin-1; Tie2; pulmonary arterial hypertension; apoptosis; caspase-3; rats

　　血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)是新发现的一类低聚分泌型糖蛋白，主要由血管内皮细胞旁细胞包括血管平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞等表达，内皮细胞本身不表达。Ang-1主要与血管内皮细胞表达的受体酪氨酸激酶Tie2相结合而发挥作用[1]。在体循环系统，Ang-1具有抑制内皮细胞凋亡，促进血管存活，维护内皮细胞层的完整性，诱导内皮细胞迁移，抑制血管渗漏和炎症基因表达以及刺激血管重构和血管发生等作用[2]。但在肺循环系统，尤其在肺动脉高压方面，Ang-1/Tie2系统的作用尚不明确。目前有关Ang-1在肺动脉高压形成中的研究主要是在低氧和药物诱导的肺高压模型上进行，其结果也存在明显的冲突和争议[3]。本实验通过建立大鼠体-肺分流肺动脉高压模型，检测大鼠肺组织内Ang-1、Tie2以及细胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)活性的变化，了解Ang-1/Tie2系统在体-肺分流先天性心脏病肺动脉高压形成中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪 器

　　ASX手术显微镜(上海安倍光学仪器制造公司)、显微手术包、BL-420E + 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)、PCR仪(PE Applied Biosystem9700， 美国)， 荧光定量PCR仪(Chromo 4BIO-RAD，美国)，凝胶成像系统(Gene UVP，英国)。

　　1.2 试 剂

　　TRIzol Reagent RNA提取试剂盒、Rabbit anti-Angiopoietin-1、 Rabbit anti-Tie2和Rabbit anti-GAPDH均购自美国Invitrogen公司;MMLV第一链cDNA合成试剂盒和Real-time PCR Master Mix试剂盒购自日本TOYOBO公司;Western及IP裂解缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Rabbit anti-caspase-3、Rabbit anti-caspase-3(激活型)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H + L)、 BeyoECL Plus和显影定影试剂盒均购自江苏碧云天生物技术研究所。

　　1.3 动物及分组

　　体质量200 ～ 250 g 的清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠36只(中山大学实验动物中心提供)，随机分为2个分流组(每组10只)和2个对照组(每组8只)。

　　1.4 大鼠肺动脉高压模型的建立

　　大鼠肺动脉高压模型的建立，参考赵翠芬[3]的方法并进行改进。简要步骤如下：分流组动物用100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，左颈部纵切口，依次充分游离左颈外静脉和左颈总动脉。血管夹夹闭左颈总动脉近心端，结扎并剪断其远心端。8-0尼龙线引导左颈总动脉断端从自制套管中穿过。固定好套管后，将左颈总动脉壁翻转，使血管内膜外翻在套管表面，尼龙线打结固定。结扎左颈外静脉远心端，血管夹夹闭近心端，用显微剪在颈外静脉上剪一小口，将翻转于套管上的颈总动脉端插入颈外静脉并用尼龙线打结固定。剪断左颈外静脉的远心端，依次松开两个血管夹，见颈外静脉迅速充盈，透过静脉壁可见来自动脉的鲜红血流冲入暗红的静脉血中，提示套管连接通畅。缝合皮肤。对照组做假手术，结扎并切断左侧颈总动脉和颈外静脉。

　　1.5 血流动力学测量

　　分别于术后第4周和第8周测量大鼠的右心室收缩压。右心室收缩压的测量方法参照魏玮等[4]的方法进行。大鼠麻醉后，经右颈外静脉插入3F硬膜外麻醉管制成的右心室测压管，末端连接生物机能实验系统的压力传感器。慢慢将测压管末端推送入右心室，待测压波形逐渐平稳后，记录右心室收缩压。

　　1.6 肺组织收集

　　测量右心室收缩压后，放血处死动物，快速开胸游离并切取双肺。将左下肺叶分为3份，其中2份装入冷冻管，放入液氮中保存，用于分子生物学检测;余下1份浸入体积分数为10%的甲醛溶液中，供组织切片用。

　　1.7 肺微细动脉壁厚度指数测量

　　常规组织切片后，观察肺微细动脉组织形态变化。显微镜下每张切片随机选取3条直径30 ～ 80 μm的肺微细动脉的横断面，利用Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析系统(光镜 × 400)，测量肺微细动脉的外径和内径。根据公式：血管壁厚度指数 = 1-血管内径/血管外径，计算肺微细动脉壁厚度指数。

　　1.8 mRNA水平上Ang-1和Tie2的检测

　　肺组织RNA的提取按TRIzol Reagent RNA提取试剂盒使用说明书进行。cDNA第一链的合成按照MMLV第一链cDNA合成试剂盒使用说明书进行。在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery)数据库上检索SD大鼠相关基因Ang-1(gi：23308738)，Tie2(gi：157787146) 的核苷酸序列，另外选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH(gi：110347607) 作为内参基因。利用Primer 5.0引物设计软件设计引物。Ang-1：上游引物5′- TAAATCAAACATCCCGTCTT-3′，下游引物5′- AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3′，扩增长度177 bp;Tie2：上游引物5′-CATCACCATAGGAAGGGAC-3′，下游引物5′-CACGGTCATAGTTAGAGTAGCA-3′，扩增长度238 bp;GAPDH：上游引物5’-TATC GGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物5′-CTGTGCCG TTGAACTTGC-3′，扩增长度140 bp。

　　Real-time RT-PCR操作按Real-time PCR Master Mix试剂盒操作说明进行。反应参数为：95 ℃，10 min→(95 ℃ × 15 s → 55 ℃ × 15 s → 72 ℃ × 15 s)× 40 cycles → dissociation curve。

　　1.9 蛋白水平上Ang-1和Tie2检测

　　肺组织经液氮研磨后，利用Western及IP裂解缓冲液抽提总蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白的浓度并稀释到同一浓度后，制样进行SDS-PAGE电泳。将电泳后的SDS-PAGE胶板和PVDF膜置于转移槽中，15 ～ 20 mA电转过夜。取出PVDF膜置于封闭液(5%脱脂奶粉/TBS)中4 ℃过夜。洗涤PVDF膜，加入5 mL一抗(以1：500稀释于1%脱脂奶粉/TBS中)，25 ℃杂交过夜;TBS洗涤后加入5 mL辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H + L)二抗(以1：100稀释于1%脱脂奶粉/TBS中)，25 ℃温育1 h;取出PVDF膜，滴加BeyoECL Plus试剂显色2 min，取膜进行压片，将曝光后的X线片做显影定影处理。利用Quantity One 4.5软件分析杂交带的灰度。

　　1.10 Caspase-3免疫染色

　　将组织切片脱蜡、水化后，用蒸馏水配置新鲜的3% H2O2，室温封闭5 ～ 10 min，蒸馏水洗涤后进行抗原修复。滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体。滴加Rabbit anti-caspase-3一抗， 4 ℃过夜后在37 ℃复温45 min。PBS洗涤后滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H + L)二抗，25 ℃温育20 min。洗涤干净后滴加试剂SABC，37 ℃温育20 min。PBS洗涤4次后进行DAB显色，后再用苏木精复染2 min、盐酸酒精分化。最后脱水、透明、封片、镜检。

　　1.11 Caspase-3活性检测

　　用1.9相同的Western Blot的方法，一抗分别用caspase-3抗体和激活型caspase-3抗体进行杂交。

　　1.12 统计学分析

　　所有计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示，用SPSS 16.0 for Windows 软件包进行分析。组间比较用单因素方差分析(analysis of variance， ANOVA)的post hoc多重比较(post hoc multiple comparisons)的方法进行分析，P﹤0.05表示差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠右心室收缩期压力变化

　　两分流组分别有8只和7只大鼠存活且套管连接通畅。右心室收缩压与肺动脉收缩压理论上是相等的。研究发现对照4周组与对照8周组相比，右心室收缩压无明显变化(P = 0.845)。两分流组右心室收缩压较两对照组均明显升高(P < 0.05)，且分流8周组右心室收缩压与分流4周组相比差值较大(P < 0.05)。到第8周时，分流组大鼠右心室收缩压达到40.22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右，形成明显的肺动脉高压(表1)。

　　2.2 肺组织形态分析及肺微细动脉壁厚度指数改变

　　正常肺微细动脉中层无完整平滑肌层，动脉壁可含有不连续的平滑肌细胞，血管内膜层由单层内皮细胞组成，管腔较大。病理切片提示，对照4周组(图1A)和对照8周组(图1B)大鼠肺微细动脉组织结构基本正常。分流4周组(图1C)肺血管内皮细胞增生肥大。分流8周组(图1D)肺微细动脉除了内皮细胞增生肥大更明显外，平滑肌细胞也肥大增生，出现完整的平滑肌层，血管腔变小。与两个对照组相比，分流4周组和分流8周组肺微细动脉壁厚度指数均明显升高(P < 0.05);而两对照组相比差别无统计学意义(P = 0.875;表1)。

　　2.3 Ang-1 mRNA和Tie2 mRNA检测

　　以GAPDH为内参，用Real-time RT-PCR检测肺组织内Ang-1和Tie2的转录表达活性。两对照组相比，Ang-1 mRNA无明显的差别(P = 0.644)。分流4周组和分流8周组Ang-1 mRNA均明显高于两对照组(P < 0.05);分流8周与分流4周相比，Ang-1 mRNA也明显增加(P < 0.05;图2)。Tie2 mRNA的变化趋势与Ang-1 mRNA基本一致。分流4周组和分流8周组Tie2 mRNA均明显高于两个对照组(P < 0.05);而且分流8周组比分流4周组Tie2 mRNA的表达量也明显增高(P < 0.05，图3)。因此，体-肺分流后大鼠肺组织内Ang-1和Tie2 mRNA的转录表达活性均逐渐升高。

　　2.4 Ang-1及Tie2蛋白表达的检测

　　利用Western Blot从蛋白水平检测Ang-1和Tie2的表达活性。Ang-1和Tie2蛋白的相对表达量分别以Ang-1和Tie2与内参GAPDH电泳条带灰度的比值表示。分流4周组和分流8周组Ang-1蛋白的表达量均明显高于两对照组(P < 0.05);分流8周组与分流4周组相比，Ang-1的表达量虽有增加的趋势，但统计学上无显著差异(P = 0.252)(图4)。分流4周组与对照4周组和对照8周组比较，Tie2表达量增加不明显，差别无统计学意义(P = 0.07)。但分流8周组Tie2蛋白的表达量明显高于两个对照组(P < 0.05);分流8周组和分流4周组相比，Tie2的表达虽有增加的趋势，但统计学上也无显著差异(P = 0.084，图5)。

　　2.5 Caspase-3的表达定位

　　通过免疫组化的方法对caspase-3的表达进行细胞定位。研究发现，caspase-3主要出现在肺微细动脉内皮细胞层，很少出现在平滑肌层。因此，体-肺分流肺动脉高压细胞凋亡主要发生在肺微细动脉的内皮细胞(图 6)。

　　2.6 Caspase-3活性检测

　　Caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子之一。35 ku的caspas-3在Asp位剪切后可产生19 ku和17 ku 的caspase-3片段，即激活型caspase-3而发挥作用。本实验中caspase-3活性即以17 ku与35 ku条带灰度的比值表示。实验发现，分流组17 ku与35 ku条带灰度的比值较对照组均明显降低(P < 0.05);分流8周组和分流4周组相比，激活型/未激活型caspase-3的变化无统计学差异(P = 0.458，图7)。

　　3 讨 论

　　肺动脉高压是一类以肺血管阻力持续增加，肺动脉压力逐渐增高为特征的疾病，其形成的分子机制尚不明确。肺动脉血栓栓塞性肺动脉高压、特发性肺动脉高压、硬皮病引起的肺动脉高压和因Eisenmenger综合征行心肺联合移植的患者的肺组织内Ang-1 mRNA和蛋白均明显升高而Tie2无明显变化。进一步将非家族性肺动脉高压与家族性肺动脉高压联系起来，认为Ang-1/Tie2/BMPR1A(bone morphogenetic protein receptor type 1A)信号可能是所有肺动脉高压形成的共同信号途径[5]。然而，对缺氧及野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的研究发现，肺组织内Ang-1的表达并无明显变化，但Tie2 的表达明显降低，细胞凋亡增多。因此认为，Ang1/Tie2信号途径在保护肺循环免受野百合碱及缺氧引起的内皮损伤方面起重要的作用，该信号途径可能具有抑制肺动脉高压形成的作用[6-7]。本实验通过套管连接左颈总动脉和左颈外静脉的方法，建立了血流动力学与体-肺循环分流先天性心脏病相似的肺动脉高压动物模型。实验发现，大鼠肺动脉压力逐渐升高，形成明显的肺动脉高压。肺组织切片提示肺血管重构，血管平滑肌细胞增生，内膜层增厚，出现肺动脉高压的病理改变。随着肺动脉压力的增高，肺血管内皮旁细胞Ang-1的表达持续增加，内皮细胞表达的Tie2也逐渐增加，而标志细胞凋亡的caspase-3却呈逐渐减少的趋势。已经发现，Ang-1与Tie2结合，诱导Tie2酪氨酸激酶磷酸化，引起磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K) p85亚单位磷酸化并激活，激活的PIK3进一步激活丝氨酸-苏氨酸激酶Akt。Akt被激活后，一方面抑制caspase-3， -7， -9的激活，上调survivin-1的表达，并且抑制线粒体释放Smac (second mitochondrial-derived activator of caspases)，共同发挥抑制细胞凋亡和促进内皮细胞存活的作用[8];另一方面引起内皮细胞的转录因子叉头框蛋白O1 (forkhead box O1，FOXO1)磷酸化，并抑制该因子的活性，从而抑制细胞凋亡[9]。此外，Ang-1与Tie2结合后还可通过STATs(activators of transcription)/p21及ABIN-2(A20 binding inhibitor of NF-κB activation-2)等多种信号途径抑制内皮细胞调亡[10]。因此，体-肺分流肺动脉高压形成的分子机制可能与肺动脉血栓栓塞及缺氧等引起的肺动脉高压并不相同。肺小动脉尤其是肺微细动脉内皮细胞凋亡减少可能是体-肺分流肺动脉高压形成过程中的重要机制。体-肺循环分流引起肺血流量增加，高血流量造成的切应力经力受体传入肺动脉内皮细胞内，引起内皮细胞Tie2的表达增加;同时，通过旁分泌的方式，引起肺动脉内皮细胞旁细胞尤其是平滑肌细胞增生并大量表达Ang-1，Ang-1与Tie2作用，抑制内皮细胞凋亡，引起血管内膜肥厚，管壁增厚，管腔变小，从而促进了肺动脉高压的形成。

　　【参考文献】

　　[1]Davis S， Aldrich TH， Jones PF， et al. Isolation of angiopoietin-1， a ligand for the TIE2 receptor， by secretion-trap expression cloning [J]. Cell， 1996， 87(8)： 1161-1169.

　　[2]Brindle NP， Saharinen P， Alitalo K. Signaling and functions of angiopoietin-1 in vascular protection [J]. Circ Res， 2006， 98(8)： 1014-1123.

　　[3]赵翠芬，常 萍，夏 伟，等. 套管连接法建立大鼠左向右分流肺动脉高压模型 [J]. 山东大学学报：医学科学版，2004，42(6)：661-663.

　　[4]魏 玮，区景松，黄达德，等. 左旋精氨酸恢复肺动脉高压一氧化氮和氧自由基的平衡 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2009，30(1)：43-46.

　　[5]Du L， Sullivan CC， Chu D， et al. Signaling molecules in nonfamilial pulmonary hypertension [J]. N Engl J Med， 2003， 348(6)： 500-509.

　　[6]Zhao YD， Campbell AI， Robb M， et al. Protective role of angiopoietin-1 in experimental pulmonary hypertension [J]. Circ Res， 2003， 92(9)： 984-991.

　　[7]Kugathasan L， Dutly AE， Zhao YD， et al. Role of angiopoietin-1 in experimental and human pulmonary arterial hypertension [J]. Chest， 2005， 128(6)： 633-642.

　　[8]Harfouche R， Hassessian HM， Guo Y， et al. Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells [J]. Microvasc Res， 2002， 64(1)： 135-147.

　　[9]Daly C， Wong V， Burova E， et al. Angiopoietin-1 modulates endothelial cell function and gene expression via the transcription factor FKHR (FOXO1) [J]. Genes Dev， 2004， 18(8)： 1060-1071.

　　[10]Makinde T， Agrawal DK. Intra and extravascular transmembrane signalling of angiopoietin-1-Tie2 receptor in health and disease [J]. J Cell Mol Med， 2008， 12(3)： 810-828.