MMP 2及TIMP 2与非小细胞肺癌的侵袭转移相关性研究

　　作者：杨大运,齐战,葛晖　　作者单位：050011 石家庄市，河北医科大学第四医院呼吸科(杨大运、葛晖)，胸外科(齐战)

　　【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2(MMP2)及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP2)在人非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与NSCLC转移、预后的相关性，分析NSCLC发生、发展、侵袭和转移的机制。方法 对MMP2和TIMP2的蛋白进行间接免疫荧光标记，采用流式细胞仪对60例非小细胞肺癌及20例癌旁正常肺组织进行定量检测。结果 MMP2、TIMP2蛋白及MMP2/TIMP2在非小细胞肺癌组织中的表达量明显高于癌旁正常肺组织(P<0.05);MMP2 蛋白表达量和MMP2/TIMP2比值与肺癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存期有关(P<0.05);TIMP2蛋白表达与患者临床病理特征均无关(P>0.05)。结论 在肺癌发生中，MMP2表达量上调，MMP2/TIMP2的失平衡，MMP2蛋白过剩，是导致非小细胞肺癌发生的主要原因。可作为非小细胞肺癌恶性程度及预后判断的指标。

　　【关键词】 肿瘤，非小细胞肺 流式细胞术 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶组织抑制剂

　　Relationship between MMP2 as well as TIMP2 and the invasion metastasis of nonsmallcell lung carcinoma 　YANG Dayun，QI Zhan，GE Hui.　Department of Respiration，The Fourth Hospital of Hebei Medical Univercity，Shijiazhuang 050011，China

　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase 2(MMP2)and tissue inhibitor of metalloproteinase 2(TIMP2)，and to explore their correlation with metastasis and prognosis in nonsmallcell lung carcinoma.Methods The expression of MMP2 and TIMP2 in 60 cases of lung cancer tissues and 20 cases of paracancerous tissues of lung was examined by flow cytometry.Results The levels of MMP2，TIMP2 and MMP2/TIMP2 were significantly higher in lung cancer tissues than those in paracancerous normal lung cancer tissues(P<0.05).The expression of MMP2 and the ratio of MMP2/TIMP2 were significantly correlated with the differentiation，TNM stage，lymphatic metastasis and patients’survival time after operation(P<0.05)，however，the expression of TIMP2 was not correlated with the clinicopathological characteristics of patients with lung cancer(P>0.05).Conclusion The overexpression of MMP2，the imbalance of MMP2 and TIMP2 are major reason for resulting in the cancer pathogenesis，which can be used as the reference indexes for the malignant degree of nonsmallcell lung carcinoma and patients’prognosis.

　　【Key words】 nonsmallcell lung carcinoma;FCM;matrix metalloproteinases;tissue inhibitor of metalloproteinases

　　肿瘤的浸润、转移是多步骤、多阶段进行的一个极其复杂的过程，癌细胞从原发灶脱落后，必须突破细胞外基质(ECM)和血管壁基底膜组成的结构屏障，才能进入宿主微循环。基质金属蛋白酶2(MMP2)是降解正常细胞和肿瘤细胞的结构支持网络的蛋白水解酶，它降解ECM，以促进肿瘤浸润、转移，基质金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP2)是MMP2的天然抑制剂，通过下调MMP2活性，对维护ECM的稳定和完整具有重要作用。本实验旨在研究MMP2、TIMP2在非小细胞肺癌中的表达水平，探讨其与病理分型、分期及临床特征的相关性，并评价其对患者预后判断的价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选择2007年我院确诊为原发性支气管肺癌并进行手术切除及纵隔淋巴结廓清的患者(诊断均经术后病理证实)60例，男33例，女27例;年龄33～75岁，平均年龄53.5岁。非小细胞肺癌(NSCLC)60例，其中鳞癌27例，腺癌33例 。对照组20例取自癌旁正常肺组织(距离肿瘤5 cm以上)。

　　1.2 流式细胞术检测方法

　　1.2.1 免疫荧光染色样品的制备：切取组织块，网搓法制备单细胞悬液。取1×106/ml细胞悬液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后悬浮于染色液(PBS+0.1%triton X100+10%山羊血清)中30 min，以增加细胞膜的通透性，并封闭非特异性抗体结合部位。间接免疫荧光法标记，分别加入染色液1∶ 50稀释的鼠抗人MMP2抗体和鼠抗人TIMP2抗体(北京中山公司)40 μl，37℃孵育60 min。PBS洗涤后加入染色液1∶50稀释的间接免疫荧光标记物荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗鼠lgG 多抗40 μl，避光室温孵育30 min，PBS洗涤，除去未结合的荧光抗体，将细胞重新悬浮于1 ml PBS中，过滤后上机检测。每次检测除以同一患者正常肺组织作为正常对照外，还设有 PBS代替一抗的阴性对照。

　　1.2.2 流式细胞仪检测方法：采用美国 BD 公司生产的 FACS 420型流式细胞仪，激发光源为2 W氩离子激光器，输出功率300 mW，激发波长为488 nm，分别进行单参数检测。所测数据、图形输入HP300 Consort 30计算机，应用相应软件处理，测量前以鸡红细胞作为标准品调校仪器的CV值在5%以内。

　　1.2.3 MMP2和TIMP2 表达的定量分析：按Morkve 等[1]提出的分析方法，以荧光指数(FI)表示它们的相对含量，公式为：FI=(样品基因蛋白表达的平均荧光强度-阴性对照的平均荧光强度)/ 阴性对照的平均荧光强度FI>1.0为 MMP2 或TIMP2 阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

　　1.3 统计学分析

　　应用SAS 8.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NSCLC与正常肺组织中MMP2、TIMP2蛋白表达量以及MMP2/TIMP2的比较

　　在腺癌和鳞癌中，MMP2蛋白定量表达值分别为1.48±0.14，1.57±0.11，高于正常肺组织1.13±0.06(P<0.05);TIMP2蛋白定量表达值分别为1.23±0.12，1.23±0.15，高于正常肺组织0.09±0.01(P<0.05);MMP2/TIMP2比值均大于1，亦高于正常肺组织(P<0.05)。

　　2.2 鳞癌与腺癌中MMP2、TIMP2蛋白表达量以及MMP2/TIMP2的比较

　　在腺癌和鳞癌中，MMP2蛋白定量表达值分别为1.48±0.14，1.57±0.11;TIMP2蛋白定量表达值分别为1.23±0.12，1.23±0.15;MMP2/TIMP2比值分别为1.20±0.11，1.25±0.12，差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 NSCLC临床病理特征与MMP2、TIMP2蛋白表达量的关系

　　肺癌高分化者MMP2蛋白表达量低于低分化者(P<0.05)，随着TNM分期增加，MMP2 蛋白表达水平上升，分期越晚，表达量越高，术后生存期<2年者，MMP2蛋白表达量明显高于≥2年者，有淋巴结转移者MMP2蛋白表达量高于非转移者(P<0.05);MMP2蛋白表达量与肿瘤大小、吸烟以及性别无关，TIMP2蛋白表达量与临床分期、分化程度、术后生存期、淋巴结转移、肿瘤大小，吸烟以及性别均无关(P>0.05)。见表1。

　　2.4 NSCLC临床病理特征与MMP2/TIMP2的比值

　　MMP2/TIMP2比值与癌细胞分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存期有关(P<0.05);与肿瘤大小，吸烟以及性别无关(P>0.05)。见表1。表1 肺癌组织中MMP2和TIMP2的阳性表达与患者临床病理特征的关系(略)

　　3 讨论

　　流式细胞术是对于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术，通过与荧光标记的单克隆抗体特异性结合，产生抗原抗体复合物。用流式细胞术检测细胞的荧光强度和荧光标记阳性细胞百分率，从而获得该基因表达蛋白的绝对计数和相对计数。浸润和转移是肿瘤的恶性标志和特征，基质金属蛋白酶在肿瘤浸润和转移中起关键作用。其中分子量为72 kDa的MMP2与肿瘤密切相关，它能特异性的降解基质膜中的主要成分Ⅳ型胶原，使基底膜丧失完整性，另一方面通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散。而TIMP2则可下调MMP2的降解活性，阻止肿瘤的局部生长和远处转移[2]。

　　本实验对比研究了60例非小细胞肺癌和20例正常肺组织中MMP2和TIMP2的蛋白表达情况，发现非小细胞肺癌中MMP2蛋白表达量上调，正常肺组织蛋白表达量低，表明在非小细胞肺癌中MMP2表达上调是一个关键事件[3]。本研究发现腺癌高于鳞癌，可能是腺癌具有高血源性转移的原因之一。本研究表明MMP2的蛋白表达量与肺癌细胞的分化程度有关，分化越低，蛋白表达量越高。MMP2的蛋白表达量与肺癌TNM分期有关，随着分期的增加而升高，分期越晚，表达量越高。MMP2蛋白表达量与生存期呈负相关，MMP2表达量越高，生存时间越短，与Leinonen 等[4]研究结果一致。

　　TIMP2是一种分子量为21kDa的非糖基化蛋白质，与MMP2形成1∶1复合物。对MMP2有较高的选择性抑制作用，既能和无活性的MMP2酶原结合，又能与已激活的MMP2结合。有研究发现外源性的活化及重组的TIMP2均能明显抑制肿瘤细胞侵袭和转移，TIMP2低表达与不良预后有关[5]，本研究发现肺癌组织中有TIMP2蛋白表达高，正常肺组织中TIMP2含量少或缺如。与正常肺组织相比，肺癌中TIMP2。蛋白表达量升高具有显著性(P<0.05)，但低于MMP2的表达，本研究发现TIMP2蛋白表达量与患者临床病理特征均无关。

　　大量研究结果表明，MMP2/TIMP2间的失衡与肿瘤的侵袭转移和患者的预后有关[6]，Still 等[7] 在前列腺良、恶性肿瘤的研究中发现，正常或良性前列腺疾病 MMP2/TIMP2 比值约在 1 左右，恶性肿瘤或预后不良疾病其MMP2/TIMP2 比值多>1;本研究发现非小细胞肺癌中MMP2/TIMP2 比值均大于1，而正常肺组织中MMP2/TIMP2小于1，提示MMP2/TIMP2的失平衡，MMP2蛋白过剩，是导致非小细胞肺癌发生的主要原因，可作为非小细胞肺癌恶性程度及预后判断的指标。

　　综上所述，MMPs及TIMPs与肿瘤侵袭转移的关系十分复杂，研究 MMP2及TIMP2与肿瘤的侵袭转移的关系，可为我们认识肿瘤进程的机理提供有力的依据，随着这一领域研究的深入，将为临床肿瘤的诊断预防提供可靠的指标，也为临床治疗肿瘤提供新的策略与方向。进一步阐明 MMP2 及其抑制剂和相关调控机制作用的机理，成为本世纪初肿瘤发生、发展和治疗研究的重要领域。

　　【参考文献】

　　1 Morkve O，Learum OD.Flow cytometry measurement of P53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissue from bronchial carcinoma.Cytometry，1991，12：438444.

　　2 Eren B，Sar M，Oz B，et al.MMP2，TIMP2 and CD44v6 expression in nonsmallcell lung carcinomas.Ann Acad Med Singapore，2008，37：3239.

　　3 Chetty C，Lakka SS，Bhoopathi P，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 suppresses tumor angiogenesis in matrix metalloproteinase 2downregulated lung cancer.Cancer Res，2008，68：47364745.

　　4 Leinonen T，Pirinen R，Bohm J，et al.Increased expression of matrix metalloproteinase2(MMP2)predicts tumour recurrence and unfavourable outcome in nonsmall cell lung cancer.Histol Histopathol，2008，23：693700.

　　5 Nishida Y，Miyamori H，Thompson EW，et al.Activation of matrix metalloproteinase2(MMP2)by membrane type 1 matrix metalloproteinase through an artificial receptor for proMMP2 generates active MMP2.Cancer Res，2008，68：90969104.

　　6 Cavalheiro BG，Junqueira CR，Brandao LG.Ratio of metalloproteinase 2 to tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in medullary thyroid carcinoma.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2009，135：812817.

　　7 Still K，Robson CN，Autzen P，et al.Localization and quantification of mRNA for matrix metalloproteinase  2(MMP  2)and tisue inhibitor of matrix metalloproteinase 2(TIMP 2)in human benign and malignant protatic tissue.Prostate，2000，42：18 25.