结核性和肺腺癌性胸腔积液中肺表面活性物质相关蛋白A、D的检测分析

　　作者：崔纪云,田广燕,林殿杰,龙成凤,初奎胜　　作者单位：青岛大学附属医院海阳分院呼吸内科， 山东 海阳 265100

　　【摘要】目的 探讨胸水中肺表面活性物质相关蛋白-A、D联合对原发性肺腺癌性与结核性胸腔积液的鉴别诊断价值。方法 收集36例原发性肺腺癌性和28例结核性胸腔积液患者的胸水，采用 western blotting检测胸水中肺表面活性物质相关蛋白A、D。结果 原发性肺腺癌和结核性胸膜炎患者胸水中SPA光密度值分别为265.1±141.16和180.0±64.1;原发性肺腺癌和结核性胸膜炎患者胸水中SPD光密度值分别为299.9±140.6和206.8±86.8。36例原发性肺腺癌患者中有23例胸水中SPA>250，有16例SPD>250，而SPA>250和(或)SPD>250有29例。28例结核性胸膜炎患者胸水中SPA、SPD均未超过250。结论 肺表面活性物质相关蛋白A对结核性胸膜炎与原发性肺腺癌所致胸腔积液鉴别诊断有临床价值,联合肺表面活性物质相关蛋白D对两者的鉴别诊断更有意义。

　　【关键词】 胸腔积液;结核，胸膜;肺肿瘤;肺表面活性物质相关蛋白A;肺表面活性物质相关蛋白D

　　Detection of lung surfactant proteinA and D in pleural effusions due to

　　lung adenocarcinoma and tubercular pleurisy

　　CUI Jiyun, TIAN Guangyan, LIN Dianjie, LONG Chengfeng, CHU Kuisheng

　　(1. Department of Respiratory Diseases, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;2. Department of Neurology, Qilu Child Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250022, China;

　　3. Department of Respiratory Diseases, Haiyang Hospital Affiliated to Qingdao University, Haiyang 265100, Shandong, China)

　　To study the value of combined determinations of surfactant associated proteinD(SPD) and A (SPA) in the pleural fluid in distinguishing lung adenocarcinoma and tubercular pleurisy. Methods SPA and SPD were determined in the pleural effusions from 36 patients with lung adenocarcinoma and 28 with tubercular pleurisy by western blotting. Results SPA concentrations in pleural effusions due to lung adenocarcinoma and tubercular pleurisy were 265.1±141.16 and 180.0±64.1 respectively, and SPD concentrations were 299.9±140.6 and 206.8±86.8, respectively. SPA>250 was found in 23 of 36 lung adenocarcinomas，SPD>250 in 16 of 36 lung adenocarcinomas， while increased values of SPA and/or SPD were found in pleural effusions from 29 of 36 lung adenocarcinomas. SPA and D values did not exceed 250 in any of 28 patients with tubercular pleurisy. Conclusions SPA is a useful immunohistochemical marker for lung adenocarcinoma, and SPA in pleural effusion is valuable in diagnosis of primary lung adenocarcinoma and tubercular pleurisy, however, a combination of SPD and A assays in pleural effusions will be better for discriminating lung adenocarcinoma from tubercular pleurisy.

　　Key words： Pleural effusion; Tuberculosis, pleura; Lung neoplasms; SPA; SPD

　　肺表面活性物质由亲水性肺表面活性物质相关蛋白A、D(surfactantassociated proteinA、D， SPA、 SPD)和疏水性肺表面活性物质相关蛋白B、C(surfactant associated proteinB、C，SPB、SPC)及磷脂组成，由肺泡2型上皮细胞合成分泌，在维持肺泡表面张力平衡及局部免疫防御中发挥重要作用。近几年的研究表明，表面活性物质在体内有广泛的分布，不仅分布于肺泡，也分布于气道、中耳、胃肠道、胸膜及腹膜等。本实验主要研究了结核性和肺腺癌性胸腔积液患者胸水中肺表面活性物质相关蛋白A、D,探讨胸水中肺表面活性物质相关蛋白A、D联合对原发性肺腺癌性与结核性胸腔积液的鉴别诊断是否更有价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　入选病例为2005年8月～2007年8月山东大学附属省立医院呼吸内科及肿瘤科首次住院未治疗的胸腔积液患者，其中36例为原发性肺腺癌，28例为结核性胸腔积液，所有病例都是病理诊断，其中结核性胸膜炎病理学诊断标准：显微镜下呈结核性肉芽肿和(或)结核结节和(或)干酪性坏死。根据各个患者病情特点，其病理组织的获取分别采用电子支气管镜、内科胸腔境检查及CT或B超引导下肺穿刺活检。

　　1.2 胸腔积液的收集

　　患者入院后第一次行胸腔穿刺时抽取胸水50?mL，置于离心管中放于4?℃离心机内，800?r/min离心10?min后，留取其上清液于-80?℃冰箱保存备用。

　　1.3 胸腔积液中总蛋白含量的测定

　　按照微量BCA蛋白定量试剂盒说明书测定(微量BCA蛋白定量试剂盒，购自上海申能博彩生物科技有限公司)。

　　1.4 SPA和SPD测定

　　采用免疫印迹(western blotting)测定：BCA蛋白定量、变性后，每孔加入相同量的总蛋白(200?μg)进行12%SDSPAGE电泳，电压开始为30?V后升至100?V，电泳后蛋白转移至硝酸纤维素膜上，10%脱脂牛奶室温封闭1?h后，加入一抗(兔IgG抗人SPA及兔IgG抗人SPD多克隆抗体，购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.)在4?℃冷室孵育过夜，用TBS洗涤3次×10?min后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.)室温孵育2?h，再用TBS洗涤3次×10?min，加入发光试剂(ECL)显色(ECL Plus Western blotting Detection Reagents，购自GE Healthcare UK Limited Amersham Place)。健康人群肺泡盥洗液作阳性对照。用图像分析软件AlphaImager 2000进行光密度积分值分析。

　　1.5 统计学处理

　　所有统计处理由SPSS10.0分析软件完成，数据统计以±s表示，采用成组设计两样本比较的秩和检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。SPA和SPD的相关性采用积差相关系数来估计。

　　2 结 果

　　2.1 结核性胸膜炎与原发性肺腺癌患者的临床资料

　　患者的一般资料、胸水中细胞计数及分类见表1。原发性肺腺癌患者的年龄相对要比结核性胸膜炎患者大些，结核性胸膜炎患者有核细胞计数更多，而两者吸烟人数无明显差异，两者均以男性患者更多见。

　　2.3 胸水中SPA和SPD表达

　　western blotting检测胸水中SPA、SPD表达，两者显影后均有多条蛋白条带，参考SPA和SPD单体蛋白分子量及阳性对照条带，认为相对分子量为80、105、120?kD的蛋白条带不是SPA或SPD的多聚体，而是胸水中非特异性杂蛋白。由图1可见，原发性肺腺癌患者胸水中SPA蛋白表达和结核性胸膜炎患者相比显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。由图2可见原发性肺腺癌患者胸水中SPD表达和结核性胸膜炎患者相比显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。SPA与SPD经相关性分析呈正相关(r=0.763)。

　　2.4 肺腺癌与结核性胸腔积液的鉴别

　　联合分析胸水中SPA和SPD的表达对原发性肺腺癌和结核性胸膜炎的鉴别诊断价值见表2。单独分析胸水中SPA表达时可使63.9%的原发性肺腺癌患者与结核性胸膜炎相鉴别，而联合分析胸水中SPD的表达则可提高到80.5%。

　　3 讨 论

　　SPA是肺表面活性物质相关蛋白的主要组成成分之一， Shijubo N 最早提出通过检测患者胸水中SPA表达来鉴别原发性肺腺癌，证实SPA是原发性肺腺癌有价值的免疫组织化学标记[1]403。此后,Takezawa C通过3种不同的方法检测了20例原发性肺腺癌患者胸水中SPA的表达，结果显示免疫细胞化学阳性率为50%，RNA阳性表达率85%，其它恶性肿瘤引起的胸腔积液及非肿瘤性胸腔积液患者均为阴性，而且原发性肺腺癌患者胸水中SPA蛋白量明显高于其它原因胸腔积液[2]。此后，关于胸水中SPA的研究很少，而对各种疾病的患者的肺泡灌洗液和血液中SPA的研究增多[34]。

　　本组实验研究28例结核性胸膜炎和36例原发性肺腺癌患者胸水中SPA，结果与文献[1]相符，原发性肺腺癌患者胸水中SPA的表达明显高于结核性胸膜炎患者，差异有统计学意义。参照Shijubo N测定原发性肺腺癌患者胸水中SPA大于100?ng/mL时对其鉴别诊断有意义[1]405，本研究SPA临界值设定为250。SPA主要由肺泡2型上皮细胞及气道Clara细胞合成分泌，分泌出的SPA蛋白与磷脂协同主要在肺泡内发挥生理作用。最近的研究显示，中耳、胃肠道、胸膜及腹膜等部位也检测到SPA蛋白[5]，但SPA蛋白是由浆膜腔内细胞合成分泌还是来自肺泡内SPA目前还不清楚。关于胸水中SPA的形成机制： Saitoch H认为胸水中SPA表达的多少主要与胸膜腔内合成分泌SPA的细胞数多少有关，胸水中的肺腺癌细胞及部分鳞癌细胞能合成分泌SPA[6]，所以原发性肺腺癌患者胸水中SPA表达明显高于结核性胸腔积液患者。结核性胸腔积液患者胸水中没有肺腺癌细胞，胸水中仍检测到SPA表达，而且个体差异较大，考虑可能的机制包括：肺泡2型细胞增生引起每个细胞分泌增加，肺泡内表面活性物质相关蛋白聚集，肺毛细血管通透性增加，基底膜损伤引起的肺泡上皮和内皮之间的屏障受损，以及表面活性物质相关蛋白血浆清除率降低，血浆内表面活性物质相关蛋白含量增高而渗出到胸腔内增加。

　　SPD主要也是由肺泡2型上皮细胞及气道Clara细胞合成分泌，其结构与SPA相似均与血清甘露糖结合凝集素(mannosebinding lectin，MBL)相似[7]，同属于C型凝集素超家族中胶原凝集素家族成员。最近的研究表明，SPA、SPD具有很多相似的功能，如两者均有调节炎性介质的合成的作用[8]，两者除了能增强免疫细胞吞噬和杀伤病原体外，还均具有直接的抗G细菌作用[9]。SPD还具有抗病毒活性作用，能与人类免疫缺陷病毒的gp120蛋白结合抑制病毒复制[10] 。SPD和SPA的结构相似，又具有很多相似的功能特点，相关性分析两者呈明显的正相关，而SPA已证实是原发性肺腺癌很有价值的免疫组织化学标记，对其鉴别诊断有意义。但关于胸水中SPD的研究较少，未检索到相关的文献。

　　本实验同时研究了28例结核性胸膜炎和36例原发性肺腺癌患者胸水中SPD的表达，结果显示原发性肺腺癌患者胸水中SPD表达明显高于结核性胸膜炎患者，差异有统计学意义。SPD与SPA相同，主要在肺泡腔内发挥生理作用，关于胸水中SPD的来源尚不清楚，由于本实验未做免疫细胞化学分析，胸水中肺腺癌细胞是否也能合成分泌SPD还无定论，而且原发性肺腺癌患者胸水中SPD>250仅占44.4%，低于SPA的63.9%，具体原因有待进一步研究。本研究结果显示，同为原发性肺腺癌患者或结核性胸膜炎患者，个体胸水内SPA和SPD还是有差异的，这种差异是否与个体胸膜粘连肥厚有关系，目前正在研究中。

　　【参考文献】

　　[1]Shijubo N, Honda Y, Fujishima T, et al. Lung surfactant proteinA and carcinoembryonic antigen in pleural effusions due to lung adenocarcinoma and malignant mesothelioma[J]. Eur Respir J, 1995, 8(3).

　　[2]Takezawa C, Takahashi H, Fujishima T, et al. Assessment of differentiation in adenocarcinoma cells from pleural effusion by peripheral airway cell markers and their diagnostic values[J]. Lung Cancer， 2002, 38(3):273281.

　　[3]Griese M, Essl R, Schmidt R, et al. Pulmonary Surfactant, Lung Function, and Endobronchial Inflammation in Cystic Fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2004, 170(9):10001005.

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　　[7] Lawson P R, Reid K B. The roles of surfactant proteins A and D in innate immunity[J].Immunol Rev， 2000, 173(1):6678.

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　　[9]Wu H, Kuzmenko A, Wan S, et al. Surfactant proteins A and D inhibit the growth of Gramnegative bacteria by increasing membrane permeability[J]. Clin Invest, 2003, 111(10):15891602.

　　[10]Jambo K C, French N, Zijlstra E, et al. AIDS patients have increased Surfactant protein D but normal mannose binding lectin levels in lung fluid[J]. Respir Res， 2007, 8(1):4248.