p21，p27基因多态性对食管癌的发生及淋巴结转移的影响

　　作者：马玉泉,杨晓光,刘晖,李保庆,刘俊峰　　作者单位：1邯郸市中心医院胸外科，河北 邯郸 056001，2河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 056370

　　【摘要】目的探讨p21基因外显子3′非翻译区(UTR)第20碱基对的核苷酸多态性(SNPs)以及p27基因第109密码子的SNP对食管鳞状细胞癌(ESCC)发生及淋巴结转移的影响. 方法： 采用聚合酶链反应(PCR)片段长度分析和PCR限制性片段长度多态性(RFLP)方法检测p21基因外显子的3′UTR第20碱基对SNP以及p27基因第109 密码子SNP位点的基因型. 结果： p21和p27的基因型分布在ESCC组及对照组中均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)，在ESCC组和对照组中，ESCC患者p21基因3′UTR和p27基因第109密码子的多态性基因型和等位基因型分布与对照组无统计学差异. 吸烟状况分层分析发现，吸烟患者p21的TT基因型频率(26.0%)显著高于健康吸烟组(12.0%)(χ2=8.60，P=0.014). 与CC基因型相比，携带TT基因型可显著增加吸烟者的ESCC发病风险. 经性别和年龄校正的比值比(OR)及其95%的可信区间(CI)分别为3.36(95%，CI=1.45～7.75)，而在非吸烟的患者和健康个体中，p21基因型及等位基因型频率差异均无统计学意义;p27基因型及等位基因型频率在吸烟及非吸烟患者和健康个体中差异均无统计学意义. 有无淋巴结转移分层分析结果表明，有淋巴结转移组的p21的TT基因型频率(26.4%)显著高于无淋巴结转移组(15.3%)(χ2=6.128，P=0.013). 与常见单体型C/C相比，携带TT基因型与TT+T/C基因型可明显增加ESCC患者淋巴结转移的风险，其性别、年龄校正的OR值及其95%的CI分别为3.11(95%，CI=1.28～7.52)和1.98(95%，CI=1.03～3.80)，而p27基因多态性在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组之间差异无统计学意义，p27基因多态性与淋巴结转移的风险性无关. 结论: p21基因3′UTR和p27基因第109密码子的多态性基因型和等位基因型不单独影响ESCC的发生和发展;p21 3′UTR的TT等位基因可能增加吸烟人群ESCC易感性，并可能增加淋巴结转移的风险性.

　　【关键词】 食管鳞状细胞癌;p21基因;p27基因;多态性;易感性;淋巴结转移

　　0引言

　　p21和p27基因是近年来发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclindependent kinase inhibitors, CDKI)家族中的重要成员[1]，其多态性与一些恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌的易感性有关[2-4]，但其与食管癌易感性的相关研究在还鲜见报道. 我们采用基于医院病例对照研究方法，观察p21，p27基因型与食管癌发病及淋巴结转移的关系，以探讨p21基因外显子3′非翻译区(untranslated region, UTR)第20碱基对的核苷酸多态性(single nucleolide polymorphisms, SNPs)以及p27基因第109 密码子的SNP对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)发生及淋巴结转移的影响.

　　1对象和方法

　　1.1对象选择2003/2005河北医科大学第四医院行胃镜检查或住院手术治疗的ESCC患者202例作为病例组，其中185例有相关淋巴结转移. 选择同期在河北医科大学第四医院行健康查体人员及河北省血站的无肿瘤及遗传病史健康献血者265例，作为对照组. 以上人员来自石家庄市或相邻市、县，均为汉族，无血缘关系. 信息由2名专业人员询问并记录. 病例组患者的年龄、性别、吸烟状态、家族史、病理类型及淋巴结转移情况来自住院病历. 以往或目前日吸烟5支以上并持续2 a以上者被定义为吸烟个体;家族中有1名以上一级亲属和/或2名以上二级亲属患者属患食管癌、贲门癌或胃癌者被定义为上消化道肿瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC)家族史阳性.

　　1.2方法抽取外周静脉血5 mL，经枸橼酸钠抗凝，于4℃冰箱保存，并于采血后1 wk内提取外周血白细胞DNA. p21，p27基因型检测采用聚合酶链反应(PCR)片断长度分析和PCR限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism analysis, RFLP)PCRRFLP方法进行. p21 SNP扩增引物 5′GAATTTGCCGTTGGGTCAAG3′(上游引物)和5′AGGAGAACACGGGATGAGGAG3′(下游引物). 3′UTR发生一个C→T的替代，从而产生一个PstⅠ限制性酶切位点，T等位基因存在该识别位点. p27 SNP扩增引物为5′TGCAGACCCGGGAGAAAG3′(上游引物)和5′CCGCTAACCCCGTCTGG3′(下游引物) ，第109密码子发生一个T→G的替代，从而产生一个BlgⅠ限制性酶切位点，G等位基因存在该识别位点. PCR反应体系均为25 μL，其中模板DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μL，TaqDNA聚合酶(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)2.5 U，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上、下游引物各0.2 μmol/L. p21 PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，64.8℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环后，72℃延伸5 min. p27 PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环后，72℃延伸5 min. 取8 μL PCR产物进行限制性内切酶消化，经30 g/L琼脂糖凝胶电泳分析基因型. 对p21，p27基因的PCR产物，分别经限制性内切酶PstI和BlgI 37℃过夜消化. 每一批PCR反应均以蒸馏水替代DNA作为阴性对照. 100 g/L DNA标本进行二次分型以证实分型方法的可靠性.

　　统计学处理：采用SPSS12.0软件包进行统计分析，基因型频率观察值和预期值采用HardyWeinberg平衡检验，病例组与对照组的基因型和等位基因型分布比较均采用χ2检验. 以非条件Logistic回归法计算经性别和年龄校正的比值比(odds ratio，OR)及其95%的可信区间(confidence interval，CI). P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1患者一般特征ESCC组与对照组间的性别、年龄构成比差异均无统计学意义. 吸烟者比例ESCC组与对照组相比差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.98). ESCC患者中UGIG家族史阳性者比例(26.2%)显著高于对照组(4.1%)(χ2=20.49，P=0.000). 经性别和年龄校正的OR值及其95%的CI为8.475(95%，CI=2.85～25). 有临床资料185例ESCC患者中，有淋巴结转移87例，无淋巴结转移98例，没有远处转移的病例. PCRRFLP检测结果显示，ESCC组与对照组p21，p27基因的多态性基因型与原始结果100%吻合.

　　2.2p21，p27基因SNPs分布p21基因T/T基因型产物为133和735 bp 2个片段;C/C基因型产物为133，256和479 bp 3个片段;C/T基因型产物为133，256，479和735 bp 4个片段(图1). p27基因T/T基因型产物为76和378 bp 2个片段;G/G基因型产物为76，113和265 bp 3个片段;T/C基因型产物为76，113，265和378 bp 4个片段(图2). p21的T，C等位基因频率和T/T，C/T，C/C基因型频率在ESCC组和对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05，表1). 吸烟状况分层分析结果发现，p21的T/T基因型频率ESCC吸烟组(26.0%)显著高于健康吸烟组(12.0%)(χ2=8.60，P=0.014). 经性别和年龄校正的OR值及其95%的CI为3.36(95%，CI=1.45～7.75)，而在非吸烟的患者和健康个体中，p21基因型及等位基因型频率差异均无统计学意义. p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC组和对照组之间均无统计学差异. 吸烟状况分层分析p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC组和对照组之间均无统计学差异(表2).

　　2.3p21，p27基因SNPs分布与ESCC淋巴结转移的关系有淋巴结转移组p21的T/T基因型频率(26.4%)显著高于无淋巴结转移组(15.3%)(χ2=6.128，P=0.013). 经性别、年龄校正的OR值及其95%的CI为3.11(95%,CI=1.28～7.52). 淋巴结转移状况分层分析结果显示, p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC组与对照组之间差异均无统计学意义(表3).表1p21，p27基因SNPs分布 表2p21，p27基因SNPs分布与吸烟的分层分析表3p21，p27基因 SNPs与淋巴结转移的关系

　　3讨论

　　p21和p27基因能诱导细胞周期阻滞，被认为是肿瘤抑制基因，其多态性及蛋白表达与多种肿瘤的易感性及预后有关[5-6]. 本研究结果显示，病例总体分析并未发现p21基因3′UTR第20碱基对的多态性与ESCC的易感性相关. 然而，对吸烟状况的分层分析发现，与CC基因型相比，携带TT基因型可使吸烟人群ESCC的发病风险增加3倍. 而在非吸烟的患者和健康个体中，p21的基因型及等位基因型频率均无统计学差异，这说明TT基因型可增加吸烟者患ESCC的风险，表明TT基因型的过量表达可能与吸烟所诱导的代谢改变相互作用，从而影响ESCC的易感性.

　　周围浸润和淋巴结转移是影响UGIC患者预后和生存率的重要因素. 因此，找到分子生物学指标来预测肿瘤浸润和转移，从而制定个体化的治疗方案具有重要价值. 通过对ESCC患者淋巴结转移情况分层后发现与CC基因型相比，携带TT基因型可使ESCC患者淋巴结转移的危险性增高3倍，携带TT+T/C基因型可使ESCC患者淋巴结转移的危险性增高近2倍，这表明携带TT或TT+T/C基因型的ESCC患者更容易发生淋巴结转移，提示携带该基因型的ESCC患者在临床治疗时应尽可能进行淋巴结清扫，并进行相应的术后综合治疗，以减少淋巴结转移病灶的残留.

　　综上所述，p27基因V109G多态性与食管癌的易感性无相关关系，经吸烟状况、淋巴结转移分层分析也未显示出差异具有统计学意义. p27基因在肿瘤细胞中很少有突变和甲基化[7]，且其功能的改变是转录后调节，因此对于其基因多态性与肿瘤易感性的相关性研究的价值可能会减少.

　　【参考文献】

　　[1] Gomes CC, Drummond SN, Guimaraes AL, et al. p21/WAF1 and cyclin D1 variants and oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med，2008, 37(3):151-156.

　　[2] Izawa H, Yamamoto H, Damdinsuren B, et al. Effects of p21cip1/waf1 over expression on growth, apoptosis and differentiation in human colon carcinoma cells[J]. Int J Oncol，2005, 27(1): 69-76.

　　[3] Li G, Sturgis EM, Wang LE, et al. Association between the V109 Gpolymorphism of the p27 gene and the risk and progression of oral squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2004, 10(12):3996-4002.

　　[4] Kibel AS, Suarez BK, Belani J, et al. CDKN1A and CDKN1B Polymorphisms and risk of advanced prostate carcinoma[J]. Cancer Res, 2003, 63(9):2003-2036.

　　[5] Brenda LP, lris LS , Paul R, et al. Associations between common polymorphisms in TP53 and p21WAF1/Cipl and phenotypic features of breast cancer[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(2):311-315.

　　[6] Li G, Liu Z, Sturgis EM, et al. Genetic polymorphisms of p21 are associated with risk of squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Carcinogenesis, 2005,26(9):1596-1602.

　　[7] 管晓翔，陈龙邦. 肿瘤细胞p27kip1蛋白错位分布和低表达的分子机制[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006, 13(10):786-789.