慢性心房颤动患者血清及心肌热休克蛋白27/60/70的表达及其意义

　　作者：潘宴青,陈鑫　　作者单位：南京医科大学附属南京第一医院心胸外科，江苏 南京

　　【摘要】 目的 探讨慢性心房颤动患者血清及心肌中热休克蛋白(HSP)的表达及其意义。方法 选取瓣膜置换手术患者40例，其中20例为房颤持续时间超过36个月，另20例为窦性心律，以ELISA法检测血清HSP27/60/70含量，以Western斑点印迹法检测右心房心肌组织中HSP27/60/70的表达水平。结果 (1)两组患者血清中HSP27/60/70含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)两组心肌组织中均见HSP27表达，但表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)慢性房颤组心肌中HSP70表达与窦性心律组比较差异有统计学意义(861.02±246.77 vs 1 068.51±332.18，P<0.05)。(4)HSP60表达水平两组比较差异也有统计学意义(5 965.03±1 564.92 vs 3 159.80±1 055.41，P<0.05)。(5)两组患者血清与心肌中HSP27/60/70作相关分析，只有窦性心律组的血清与右心房心肌HSP27表达水平呈低度相关(r=0.54，P<0.05)。结论 右心房心肌中HSP60及HSP70的表达在慢性心房颤动的发生和发展中起重要作用。

　　【关键词】 慢性心房颤动 热休克蛋白 酶联免疫法 斑点印迹法

　　Expression and significance of HSP27/60/70 in right serum and atrial of patients with chronic atrial fibrillation

　　PAN Yanqing, CHEN Xin

　　Department of Cardiovascular Surgery, the Nanjing First Hospital Affiliated of

　　Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China

　　Abstract:Objective To investigate the expression and significance of heat shock protein (HSP) in human chronic atrial fibrillation. Methods Right atrial samples and serum samples were obtained from forty patients undergoing valve replacement, in which twenty patients had chronic atrial fibrillation(AF). The rest of patients suffered from sinus rhythm(SR).The HSP27/60/70 expression level in right atrial samples was determined by Westernblot, while the expression in serum samples was determined by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA). Results (1)There was no difference of HSP27/60/70 expression between serum samples of two groups. (2) HSP 27 were expressed in both groups, while no significant difference of expression level existed (605.66±189.03 vs 584.34±144.79,P>0.05). (3) Compared with SR, the AF group had higher level of HSP 60(5 965.03±1 564.92 vs 3 159.80±1 055.41, P<0.05). (4)Compared with SR, the AF group had lower level of HSP 70(861.02±246.77 vs 1 068.51±332.18,P<0.05). (5)In the SR group the expressions of HSP27 in right atrial and serum samples were related (r=0.54，P<0.05).Conclusion The expression of HSP60 and HSP70 may play a important role in chronic atrial fibrillation.

　　Key words:chronic atrial fibrillation; heat shock protein; enzymelinked immunosorbent assay; Westernblot

　　慢性心房颤动(简称慢性房颤)是临床最常见的心律失常，有70%左右发生于器质性心脏病患者，其中以瓣膜性心脏病、先天性心脏病和冠心病常见[1]。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一种在进化过程中序列高度保守的生物蛋白，对维持机体的自身稳定性起重要作用,是细胞应激反应的生物标志及细胞的内源性保护蛋白[23]。近年来，部分研究提示HSP家族和房颤的发生发展可能存在一定联系。本研究对慢性心房颤动患者血清及右心房心肌中HSP 27/60/70的表达进行检测，旨在探索慢性房颤可能的发生发展机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择

　　选取2007年8月至2007年10月间在本院行瓣膜置换手术患者，慢性房颤(AF)组选取20例房颤持续时间>36个月者，其中行二尖瓣置换术8例、主动脉瓣置换术6例、二尖瓣加主动脉瓣置换术6例;窦性心律(SR)组选取20例，其中行二尖瓣置换术10例、主动脉瓣置换术6例、二尖瓣加主动脉瓣置换术4例。两组患者年龄及性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，右房直径(RAD)、左房直径(LAD)及左心室舒张末期直径(LVDd )均AF组大于SR组(均P<0.01),射血分数(EF) SR组大于AF组(P<0.01)。见表1。所有患者的瓣膜术后均送检，病理检查结果符合风湿性瓣膜病变表现。表1 两组患者临床资料比较(略)注：LAD为左心房直径;LVDd为左心室舒张末期直径;RAD为右心房直径;EF为左室射血分数

　　1.2 标本留取及保存

　　所有患者入院时抽取静脉血10ml,离心后取血清保存于-20℃冰箱备用。组织标本于手术进行到体外循环开始前，取右心耳组织,立即置-70℃液氮保存。

　　1.3 实验方法

　　用ELISA法检测血清HSP27/60/70, 试剂盒均为美国ADL公司产品，实验步骤按说明书进行操作。用Western斑点印迹法检测心肌中HSP27/60/70，检测方法按参考文献[4]。

　　1.4 数据统计及比较

　　所有的定量数据均用x-±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学处理，组间数据比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 两组患者血清中HSP27/60/70含量测定

　　见表2。两组患者血清中HSP27/60/70含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表2 两组患者术前血清HSP检测结果比较(略)

　　2.2 两组患者心肌中HSP27/60/70含量测定

　　两组患者心肌组织中HSP27表达未见明显统计学差异(P>0.05);HSP70表达水平AF组含量明显低于SR组(P<0.05); HSP60表达AF组含量明显高于SR组(P<0.01)。见表3。表3 两组患者心肌HSP检测结果比较(略)

　　2.3 两组患者血清及心肌中HSP27/60/70相关性分析

　　只有SR组血清与右心房心肌中HSP27存在低度相关性(r=0.541，P<0.05),见表4、5。表4 AF组患者血清与心肌中HSP27/60/70相关性分析(略)表5 SR组患者血清与心肌中HSP27/60/70相关性分析(略)

　　3 讨 论

　　HSP又称应激蛋白(stress protein，SP)，根据其分子质量大小和氨基酸序列同源性不同，将主要的HSP分为4个家族：HSP90家族、小分子量smHSP家族、HSP60家族和HSP70家族。HSP在抗氧化、协同免疫、抗细胞凋亡方面发挥重要作用[23]。

　　心房颤动是临床最常见的心律失常之一。近年来，国内外学者部分研究结果提示房颤的发生和HSP家族可能有相关性[514]。本研究提示两组患者术前血清中HSP27/60/70含量差异均无统计学意义(P>0.05)，和Mandal等[6]观察结果相符，故目前认为血清中HSP27/60/70和慢性房颤发生关系不大。

　　本研究结果显示两组患者心肌组织中HSP27表达差异未见统计学意义(P>0.05)。HSP27 是smHSP亚家族中的重要一员，Yang等〔15〕研究结果提示特发性房颤组患者心肌中HSP27表达较另两组增高。Kampinga等[16]认为HSP27可抑制房颤的持续发作，Brundel等[17]研究提示特发性房颤组患者心肌中HSP27表达较另两组增高，故目前认为HSP27能够抑制特发性房颤向持续性房颤转化，但对已经形成的慢性持续性房颤无特殊抑制作用。HSP27对心肌细胞的保护机制主要包括：(1)促进GSH 生成,提高细胞内还原能力; (2)抑制细胞色素C (CytC) 释放和Cyt C 凋亡蛋白酶激活因子1复合物形成; (3)抑制caspase 前体活化; (4)稳定细胞骨架。

　　本研究结果提示患者右心房心肌组织中HSP70表达AF组低于SR组，差异有统计学意义(P<0.05)。HSP70是相对分子质量约为70 000的热休克蛋白。Rammos等[1819]观察到HSP70在心肌中高表达患者房颤发生率低。风湿性心脏瓣膜病变导致免疫系统应激，引起心肌细胞HSP70含量增加。目前认为房颤发生和自我持续的核心环节包括心房电重构、收缩功能重构和结构重构 [1,1920]，而HSP70在心肌中表达可维持心房肌细胞的正常形态结构从而抑制慢性房颤发生及持续[25]。其作用机制主要包括：(1)参与离子通道修复、恢复氧化还原平衡、阻止凋亡途径启动;(2)稳定细胞膜和溶酶体膜，防止蛋白质变性;(3)促进变性蛋白质的复性水解，维持蛋白质结构，从而保护细胞;(4)作为分子伴侣保护MnSOD和CAT等细胞内的抗氧自由基酶免受损伤;(5)抑制细胞因子的炎症反应，起非特异免疫保护作用。

　　本研究结果提示两组患者心肌中HSP60表达差异有统计学意义(P<0.05)，AF组含量明显偏高。HSP60是相对分子质量约60 000的热休克蛋。Schafler等[21]研究结果提示慢性房颤患者心肌中HSP60含量较窦性心律患者明显增高。Kirmanoglou 等[22]观察到慢性房颤患者心肌组织中除HSP60和HSP10表达增多外，使HSP最终完成折叠和转运的蛋白Martlin表达也增高。慢性房颤患者心肌细胞发生形态结构变化后耗氧量明显增高。目前有研究表明心肌细胞HSP60能使ATP依赖的蛋白质叠起，增加ATP酶活性，分解ATP，满足心肌细胞需求[3]，还可能通过如下途径发挥作用：(1)作为“分子伴侣”，参与蛋白质的折叠、装配、降解、转移和修复，维持细胞的自稳。但与HSP70 相比只能恢复部分折叠或凝聚多肽的天然构象,且作用于蛋白质的时间要迟于HSP70。(2)发挥免疫监督和抗原提呈作用。(3)阻止活性氧导致的DNA链断裂，防止脂质过氧化，保护线粒体的结构和功能发挥抗氧化作用。(4)抗细胞凋亡及参与抑制应激激活激酶途径。但目前也有研究结果显示HSP60可导致E选择素、ICAM1、VCAM1等细胞间黏附分子的表达，促进心肌结构重构，故HSP60在慢性房颤患者心肌中表达后可能不完全是保护性作用[23]。

　　热休克蛋白家族和慢性房颤的发生发展有关。细胞内HSP70合成增多，可能通过参与心肌细胞离子通道修复、稳定细胞膜和溶酶体膜、防止蛋白质变性等途径以维持心肌细胞的正常结构及功能以避免房颤的发生;心肌细胞合成HSP60增多，通过抗细胞凋亡及参与抑制应激激活激酶途径、增强分解ATP满足心肌细胞需氧等途径以保护心肌细胞，但同时也可能导致细胞间黏附分子的表达来促进心肌结构重构，故HSP60在慢性房颤患者心肌中表达后可能不完全是保护性作用。HSP27可能是通过防止心肌细胞溶解从而保护心肌，防止突发性房颤向慢性持续性房颤转化。HSP27、HSP60及HSP70可能是在慢性房颤的发生及持续发作的不同阶段发挥其心肌保护作用，但具体保护机制尚有待进一步研究。

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