非小细胞肺癌血清及癌组织中EGFR蛋白定量检测

　　作者：李新举　　作者单位：1西安交通大学医学院第一附属医院胸外科，陕西 西安 710061，2西安交通大学医学院第二附属医院胸外科，陕西 西安 710065，3西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系，陕西 西安 710061

　　【摘要】目的：探讨EGFR蛋白定量水平与非小细胞肺癌(NSCLC)的临床生物学行为及预后的关系. 方法： 采用双抗体夹心ELISA法定量检测30例NSCLC患者及17例良性肺疾病和健康对照者血清和组织中EGFR蛋白水平. 结果： 30例NSCLC患者血清和癌组织中EGFR蛋白水平升高(P<0.01)，且EGFR蛋白水平与NSCLC患者TNM分期及淋巴结转移呈正相关(P<0.05). 但NSCLC患者术前血清EGFR蛋白水平与术后3 d及10 d的血清水平无统计学差异(P>0.05). 结论： EGFR蛋白水平与NSCLC的发生、发展和转移密切相关，血清EGFR蛋白水平可作为评估NSCLC进展、复发和预后的有价值指标.

　　【关键词】 癌 非小细胞肺 受体 表皮生长因子 酶联免疫吸附测定

　　0 引言

　　近年来全球肺癌的发病率和死亡率迅速上升，在许多国家和地区跃居各种肿瘤之首. 随着分子生物遗传学研究的深入，人们试图用分子手段去预防、诊断和治疗肺癌. 表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)及其信号传导通路是目前研究较多的分子靶点，其信号传导通路的异常在肿瘤的发生、发展中起着重要的介导作用，以EGFR信号传导通路为靶点的抗癌治疗也已取得令人瞩目的效果. 然而目前对于EGFR与非小细胞肺癌(NSCLC)临床生物学行为及预后的关系等方面的认识仍有争论，且EGFR在非小细胞肺癌患者血清中的含量少见报道，在非小细胞肺癌组织中的含量未见报道. 因此，本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测非小细胞肺癌患者手术前后血清及癌组织中EGFR蛋白含量，探讨非小细胞肺癌组织和血清中EGFR蛋白含量关系及其与肺癌临床病理特征的关系，为临床肺癌的诊断及治疗提供依据.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　选择200508/200601在西安交通大学医学院第一附属医院胸外科非小细胞肺癌行手术治疗，无肝炎、糖尿病以及免疫系统疾病等合并症的患者30(男20，女10)例，年龄45～70(平均57.78)岁;鳞癌17例，腺癌13例. 病理分期(pTNM):Ⅰ期与Ⅱ期20例，Ⅲ期10例. 另选择健康志愿者10例和肺良性病患者7例作为对照组. 抗EGFR单克隆抗体(包被抗体)，EGFR标准品及辣根过氧化物酶标记的EGFR多克隆抗体(酶标抗体)均购自武汉博士德生物工程有限公司. 包被缓冲液，酶结合抗体缓冲液，匀浆介质，牛血清清蛋白(BSA)，考马斯亮兰G250染料均由西安交通大学医学院免疫教研室提供. 底物显色液及反应中止液由深圳晶美生物工程有限公司生产.

　　1.2方法

　　1.2.1标本制备抽取良性病例组及肺癌病例组术前1 d、术后3 d及术后10 d清晨空腹静脉血2 mL，分离血清，低温(-80℃)冻存待检. 另外，良性病例组及肺癌病例组均于手术当日切取病变组织，称重后制作成组织匀浆待检.

　　1.2.2结果判定根据EGFR标准品不同浓度及其对应的吸光度(A值)制作标准曲线，计算回归方程，得出EGFR浓度与吸光度之间的直线方程，再根据样本的吸光度，利用回归方程计算出样本中EGFR浓度. 血清样本中EGFR浓度再乘以稀释倍数，得出最终结果，单位为μg/L. 组织匀浆样本中EGFR浓度再除以各组织匀浆样本总蛋白的浓度，得出单位重量组织匀浆样本中EGFR浓度，单位为μg/g.

　　统计学处理：用SPSS13.0软件包进行统计学处理. 考马斯亮兰法和ELISA检测的标准曲线通过直线回归分析获得. 数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验，两变量关系研究采用相关性分析法. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1NSCLC和良性病例及健康对照组术前血清中EGFR含量的比较NSCLC和良性病例及健康对照组术前血清EGFR含量分别为16.4±3.6，9.2±3.8和9.0±2.4 μg/L,3组之间EGFR含量有统计学差异(P<0.05).

　　2.2NSCLC和良性病例组组织匀浆中EGFR含量的比较NSCLC组和良性病例组组织匀浆中EGFR含量分别为93±23，64±19 μg/g，有统计学差异(P<0.05).

　　2.3NSCLC患者术前血清及癌组织匀浆中EGFR含量与肺癌病理特征的关系NSCLC患者术前血清及癌组织匀浆中EGFR含量与有否淋巴结转移及TNM分期之间有统计学差异(P<0.05),与肿瘤大小、细胞分化程度之间无统计学差异(P>0.05，表1).

　　2.4NSCLC和肺良性病患者术前及术后血清中EGFR含量的动态变化NSCLC患者术前1 d、术后3 d及术后10 d血清中EGFR含量分别为16±3，16±3和15±3.2 μg/L，术前1 d与术后3 d及术后10 d相比无统计学差异(P=0.635). 术后10 d血清中EGFR含量与良性病例组及健康对照组血清中EGFR含量之间仍存在统计学差异(P=0.043).表1NSCLC患者术前血清及癌组织匀浆中EGFR含量与肺癌病理特征的关系(略)

　　2.5NSCLC患者术前血清中EGFR含量与癌组织匀浆中EGFR含量的相关性通过相关性分析，NSCLC患者术前血清中EGFR含量与肺癌组织匀浆中EGFR含量具有相关性，其相关系数为0.845(P<0.01)，说明两者之间呈正相关.

　　3讨论

　　肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的肿瘤之一，其中约85%为非小细胞肺癌(NSCLC). 虽然目前内外科技术有了较大改进，但NSCLC患者的5 a生存率仍没有得到明显改善. 因此寻求新的诊断、治疗NSCLC的措施十分必要. EGFR及其信号传导通路在正常细胞的增殖调控以及人类肿瘤的发生、发展中的作用日益引起人们的重视. EGFR酪氨酸激酶域活化[1]后主要通过RasMAPK通路、PI3KAkt通路以及非经典的STAT通路等把各种细胞信号传递到细胞核内，调控生长、分裂等细胞正常生物反应[2]. 肿瘤细胞中存在EGFR信号传导通路如EGFR过度表达、EGFR突变等的异常，从而促进细胞不断增殖并抑制其凋亡，导致生长调节失控;此外还可以促进肿瘤新生血管的生成、提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[3]. 对EGFR信号的干扰能够阻断肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤生长，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗提供了理论基础和实验依据[4]. 然而目前对EGFR与NSCLC肿瘤分期、淋巴结转移、预后等临床病理特征关系的认识仍存在争论，这与用于检测EGFR的方法存在一定的局限性有很大关系. 本实验采用ELISA法定量检测NSCLC患者血清及癌组织匀浆中EGFR水平，探索EGFR水平与NSCLC发生、发展、转移等肿瘤生物学行为的关系及其临床意义.

　　正常细胞中EGFR的表达范围约为4×104～10×104个/细胞. 其在大部分肿瘤细胞中存在过度表达，一些乳腺癌细胞的EGFR表达可达2×106[5]. 关于EGFR在肿瘤中的过度表达率各家报道不一. 本组研究显示健康对照组血清中EGFR表达为(9.01±2.44)μg/L，而国外文献报道[6]健康人血清中EGFR表达范围为2.3～44.5 μg/L，差异较大，考虑可能与检测所用的抗体、用量、效价以及实验处理方式等差异有关. 另外，通过单因素方差分析显示良性肺疾病组和NSCLC组血清中EGFR水平有显著差异;也有显著性差异(P<0.05);NSCLC癌组织匀浆中EGFR表达水平与血清中EGFR表达水平呈正相关。血清中EGFR表达升高在一定程度上提示相应的组织EGFR表达升高,推测可能与组织中高表达的EGFR胞外域向外周血循环释放增多有关. 目前关于EGFR在血清及组织中表达相关性的研究罕有报道，对EGFR胞外域从组织细胞脱落并释放入血液循环的过程和影响因素亦不甚了解，需深入研究.

　　NSCLC组术前1 d、术后3 d及术后10 d血清中EGFR表达水平分别为(16.57±3.20)，(15.81±3.46)和(15.37±3.16)μg/L，3组间表达水平无显著统计学差异(P>0.05). 推测可能与EGFR蛋白在体内的代谢半衰期有关. 提示术后10 d以上检测血清EGFR水平有意义.

　　虽然许多资料显示EGFR参与了某些肿瘤的侵袭、转移等恶性生物学行为，但目前对EGFR表达与肿瘤分期、淋巴结转移等NSCLC临床病理特征的关系尚有争论. Peter[7] 等用免疫组化法研究298例NSCLC肿瘤组织中EGFR的表达情况，结果53% NSCLC 高表达EGFR，且EGFR高表达与肿瘤大小、有无淋巴结转移及术后生存期无关. Milas[8]等用免疫组化法检测29例非小细胞肺癌脑转移患者肺癌组织中EGFR表达，结果发现EGFR过表达与肺癌淋巴结转移显著相关. 宋萍等[9]用荧光定量PCR技术检测42例非小细胞肺癌患者及18例良性肺疾病患者外周血EGFR mRNA表达，非小细胞肺癌患者外周血EGFR mRNA表达阳性率为45.2%,良性肺疾病患者外周血无阳性表达. ⅠⅡ期和Ⅲ期的阳性率分别为18.75%和58.82%. NSCLC患者外周血EGFR mRNA表达阳性率及表达量随临床分期升高而增高，且与NSCLC的早期转移密切相关. 本研究发现NSCLC患者血清及癌组织中EGFR表达水平与有无淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.05)，有淋巴结转移的NSCLC癌组织中EGFR水平显著高于无淋巴结转移者Ⅲ期NSCLC癌组织中EGFR水平亦显著高于Ⅰ+Ⅱ期，以上结果也提示肺癌组织中EGFR表达与血清中EGFR表达的相关性. 过表达EGFR的晚期肿瘤组织可释放较多的EGFR蛋白进入血循环，亦可释放完整的肿瘤细胞进入血循环，而这些肿瘤细胞又可以过度表达和释放EGFR蛋白，从而导致血清中EGFR蛋白的高表达.

　　总之，EGFR蛋白在非小细胞肺癌的发生发展中起重要作用，为肺癌的诊治提供新途径.

　　【参考文献】

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　　[4]Ciardielloa F, Tortora G. Epidermal growth factor receptor(EGFR)as a target in cancer therapy: understanding the role of receptor expression and other molecular determinants that could influence the response to antiEGFR drugs[J]. Eur J Cancer，2003,39(10):1348-1355.

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　　[7]Peter TR, Hironobu K, Robert A, et al. Amplification and overexpression of the cyclin D1 and epidermal growth factor receptor genes in nonsmall cell lung cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，1999,125:61-70.

　　[8]Milas I, Komaki R, Dulski KM，et al. Epidermal growth factor receptor, cyclooxyenase2, and BAX expression in the primary nonsmall cell lung cancer and brain metastases[J].Clin Cancer Res，2003,9(3):1070-1076.