滚压泵建立猪肺持续灌注与缺血再灌注模型

　　作者：孔祥,赵曙光,马良龙,黄惠民,范　　作者单位：同济大学附属东方医院心胸外科,上海 200120, 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心胸心外科,上海

　　【摘要】目的：通过滚压泵建立一种操作简单的猪肺持续灌注和缺血再灌注模型, 并比较两种灌注方法对肺的损伤. 方法： 18只乳猪随机分为对照组，缺血再灌注(IR)组和非搏动持续灌注(NCP)组, 每组6只. 分别在右心房、左心房和肺动脉插管，灌注前引流全部血液入贮血器. 将贮血器中灌注液通过滚压泵泵入肺动脉, 灌注双肺后再通过左心房插管将灌注液引回贮血器, 从而建立猪肺灌注模型. 对照组双肺保持生理灌注120 min;IR组双肺缺血90 min后，滚压泵灌注30 min;NCP组滚压泵持续灌注双肺120 min. 测定实验0 min和120 min时肺静态顺应性以及灌注液中TNFα，IL6浓度. 实验后测定肺组织湿干比并进行光镜和电镜观察. 结果： 与0 min相比，IR组肺顺应性(P<0.05)下降，灌注液TNFα(P<0.05)和IL6浓度(P<0.05)升高. 120 min时，NCP组肺顺应性(P<0.05)和湿干比(P<0.05)均优于IR组. IR组灌注液TNFα(P<0.05)高于NCP组. NCP组光镜和电镜下的肺损伤程度轻于IR组. 结论： 通过滚压泵建立猪肺持续灌注和缺血再灌注模型具有操作简便的特点;非搏动持续性灌注较之缺血再灌注对肺的损伤更轻.

　　【关键词】 动物模型;肺;再灌注损伤

　　基金项目：国家自然科学基金(30170929)

　　Establishment of porcine isolated lung ischemia perfusion model and continuous perfusion model using roller pump

　　KONG Xiang, ZHAO ShuGuang, MA LiangLong, HUANG HuiMin, FAN HuiMin, LIU ZhongMin

　　Department of Cardiothoracic Surgery, Shanghai East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China, Department of Cardiothoracic Surgery, Shanghai Childrens Medical Center, Medical College, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China

　　【Abstract】AIM: To observe if the ischemiareperfusion (IR) injury to the lung is more serious than the continuous perfusion injury to the lung by establishing a new isolated lung perfusion model in piglets using a roller pump. METHODS: Eighteen piglets were randomly divided into control group, IR group and nonpulsatile continuous perfusion (NCP) group, with 6 in each group. Three catheters were respectively inserted into the right atrium，left atrium and main pulmonary artery. The whole blood was drained into the resevior through the right atrium catheter before the lung perfusion. The perfusion solution in reservior was pumped into the main pulmonary artery by a roller pump, and the solution was drained back to the reservoir from the left atrium. In control group, the lung was perfused by the heart at a physiological state for 120 min. In IR group, the lung perfusion started after 90 min ischemia and the perfusion lasted 30 min at the flow of 80 mL/kg•min. In NCP group, the lungs were continuously perfused by the roller pump at the same flow for 120 min. The lung compliance, the contents of TNFα and IL6 in the perfusate were measured at the time points of 0 min and 120 min. The lung wet to dry weight ratio (W/D) was determined after perfusion. Histological and ultrastructural changes of the lung were also examined after experiment. RESULTS: In IR group, compared to the parameters at 0 min, the lung compliance was lower (P<0.05), and the contents of TNFα and IL6 were higher (P<0.05). At 120 min, the lung compliance and the W/D in NCP group were significantly better than those in IR group (P<0.05). The contents of TNFα (P<0.05) in IR group were significantly higher than that in NCP group. It also showed milder lung injury in NCP group through light and electron microscope examination. CONCLUSION: The results bears out that the continuous perfusion injury is milder than the ischemiaperfusion injury to the lung, and the convenient operation indicates this models reliability and feasibility.

　　【Keywords】 animal model; lung; reperfusion injury

　　0 引言

　　动物肺灌注模型被广泛用于移植肺保存、肺缺血再灌注损伤以及肺肿瘤局部药物灌注等的研究. 本文探讨通过滚压泵建立操作简单并且更为接近临床实际的乳猪肺缺血再灌注和非搏动持续灌注模型, 并比较这两种灌注方法对肺的损伤程度.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 上海市松江区松联实验动物场提供的上海种乳猪18头，雌雄不拘，年龄4～5 wk，体质量7～10 kg，随机分为对照组、缺血再灌注组(ischemiareperfusion，IR)组和非搏动持续灌注(nonpulsatile continuous perfusion，NCP)组, 每组6只.

　　1.2 方法

　　1.2.1 手术操作 将已禁食12 h的乳猪以阿托品20 μg/kg，氯胺酮15 mg/kg 肌注和硫喷妥钠25 mg/kg耳缘静脉推注诱导麻醉，气管插管，接Svervo 900 C呼吸机(德国Siemens Elema AB公司)控制呼吸，采用控制通气模式，呼吸频率20次/min，潮气量15 mL/kg，吸入氧浓度400mL/L. 以硫喷妥钠和氯化琥珀胆碱交替维持麻醉. 解剖左侧腹股沟区，游离左侧股动静脉，分别穿刺置管，通过股动脉监测血压和抽取血样，通过股静脉建立静脉通道. 连续监测心电图和动脉血压. 经胸骨正中切口劈开胸骨，剪开并悬吊心包，游离暴露心脏及大血管. 分别在左右心耳和肺动脉缝大小合适的荷包. 肝素化(3 mg/kg)后，以10 F动脉插管插入肺动脉，以两根16 F静脉插管分别插入左、右心耳. 通过右心耳插管将自体血约400mL引入FCR1型一次性贮血器(宁波菲拉尔医疗用品厂)，与贮血器中预充的200 mL明胶(40 g/L)一起组成含自体血灌注液. 通过Sarns 7400滚压式血泵(美国Sarns INC 公司)将贮血器中的含血灌注液经肺动脉插管泵入肺动脉，灌注双肺，再通过左心耳插管将灌注液引回贮血器，从而建立乳猪肺持续灌注和缺血再灌注模型. IR组，全身血液引入贮血器后即开始实验，停止肺部灌注90 min后，通过滚压泵以80 mL/(kg•min)的流量灌注双肺30 min，实验结束. NCP组，全身血液引入贮血器后，立即开始实验，通过滚压泵以80 mL/(kg•min)的流量灌注双肺120 min，实验结束. 对照组开胸插管后, 不将血液引入贮血器， 在保持心脏跳动的情况下, 保持双肺的自然灌注状态120 min. 三组实验时间均为120 min.

　　1.2.2 指标监测 实验开始和结束时测定气道平台压和潮气量，计算肺静态顺应性. 放免法检测实验开始和结束时灌注液中TNFα及IL6变化(试剂盒由301医院提供)，采用SN695A型智能放免γ测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂)测量. 实验结束时取左下肺组织，分为三部分. 第一部分称湿质量后，置60℃恒温烘烤48 h称干质量，计算湿干比(W/D). 第二部分40 g/L甲醛固定, 苏木素伊红染色, 在光镜下观察肺组织内水肿和多形核白细胞浸润情况. 第三部分戊二醛固定, 常规方法制片, 在透射电镜下观察肺组织超微结构改变.

　　统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理. 计量资料用x±s表示, 采用单因素方差分析，组间比较用Dunnett法，组内比较用SNK法. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 各组肺顺应性、炎症因子、W/D比较 0 min时3组动物的肺静态顺应性、炎症因子浓度无统计学差异. 120 min时缺血再灌注组肺顺应性低于其他两组(P<0.05)， TNFα浓度、W/D高于其他两组(P<0.05). 120 min时持续灌注组和对照组中这3项指标无统计学差异. 缺血再灌注组120 min与0 min时相比，肺顺应性降低、灌注液TNFα和IL6浓度升高(P<0.05). 其他两组120 min与0 min相比，肺顺应性、灌注液炎症因子浓度无变化(表1).

　　表1 各组肺静态顺应性、灌注液炎症因子及肺湿干比比较(略)

　　a P<0.05 vs 对照; cP<0.05 vs 缺血再灌注; eP<0.05 vs 本组0 min;Cstat:肺静态顺应性.

　　2.2 各组肺组织光镜和电镜表现 缺血再灌注组光镜下可见肺泡壁增厚, 肺间质水肿, 多形核白细胞浸润, 毛细血管内微血栓形成, 肺组织渗出增加. 而持续灌注组上述变化不明显(图1). 透射电镜下可见缺血再灌注组Ⅱ型上皮细胞明显肿胀，板层小体脱颗粒现象明显，旁边的毛细血管有淤血现象. 持续灌注组Ⅱ型上皮细胞板层小体内尚有较多的颗粒，说明相关炎性物质尚未完全释出(图2).

　　3 讨论

　　胸心外科许多新的治疗手段，如体外循环心脏手术、肺移植手术、袖式肺叶切除手术以及肺部的抗肿瘤药物灌注等，都牵涉到了对肺的缺血再灌注或者非搏动性持续灌注问题. 建立合适的动物肺灌注模型对于深入研究这些治疗手段对机体的影响是十分重要的.

　　A: 对照组;B： 缺血再灌注组;C：持续灌注组.

　　图1 肺组织光镜表现 HE×40(略)

　　A: 对照组;B： 缺血再灌注组;C：持续灌注组.

　　图2 肺组织透射电镜表现 TEM ×6000(略)

　　早期的肺灌注模型一般为体外灌注，多局限于鼠、兔等小型动物，经过改进, 模型的建立均是应用颈胸腹联合切口，肝素化后分别结扎上下腔静脉、升主动脉，通过右心室切口穿越肺动脉瓣实现肺动脉插管，通过左心室切口，穿过二尖瓣实现左心房插管;随后将心肺气管连同肺动脉插管、左心房插管和气管插管整块移出胸腔，进而在体外通过灌注系统建立全肺灌注模型[1-2]. 晚些时间出现的大动物肺灌注模型的手术方法主要为肝素化后主动脉和上下腔静脉分别结扎，通过肺动脉灌注保护液，将心肺整块切除移出胸腔后，把心肺浸泡在保护液中，进而通过肺动脉和左心房插管，建立双肺灌注模型[3]. 体外肺灌注模型建立需要完全将心肺取出，操作复杂，耗时. 为简化操作发展了在体的左肺隔离灌注模型. 大鼠模型为左侧后开胸，分离左肺门的左肺动静脉，钳夹或者结扎左肺门，通过静脉以及气管注射甲基兰以确保肺门阻断完全[4]. 猪的单侧肺灌注模型则较复杂，左侧切除肋骨进胸，结扎半奇静脉后，分离左肺门结构，分别分离结扎左肺动脉、左主支气管和左肺上下静脉，通过左肺动脉和左肺上下静脉插管实现左肺灌注[5-6]. 本实验通过Sarns 7400滚压式血泵建立乳猪在体隔离肺非搏动持续灌注和缺血再灌注模型. 该模型较之小动物更为接近临床;较之离体肺灌注模型，不需要进行心肺的广泛游离，操作难度明显减低，时间明显缩短;较之其它在体隔离肺灌注模型，不需要解剖肺门的众多结构，并且能同时灌注双肺. 本研究还提示不论是非搏动持续灌注还是缺血再灌注由于都不是生理性的灌注，因此对肺脏皆有一定程度的损伤. 但是在合适的预充液渗透压、左心耳引流及灌注流量等条件下，可以使肺在非搏动持续灌注下受到较为轻微的损伤，较之缺血再灌注对肺脏有明显的保护作用.

　　【参考文献】

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