血管吻合口内膜增生性再狭窄

　　作者：袁链,张小明　　作者单位：北京市，中国中医科学院广安门医院外科(袁链);北京大学人民医院血管外科(张小明)

　　【关键词】 血管吻合口;血管内膜增生;狭窄

　　动脉粥样硬化是一种累及大中动脉的全身性病变，发生在中老年人下肢的动脉硬化性闭塞是血管外科的常见多发病之一。通过自体大隐静脉或人工血管旁路移植跨越闭塞段，重建血液流入道是目前治疗下肢动脉硬化性闭塞的主要手段之一，尤其是对于长段闭塞无法进行介入治疗的患者。但是旁路移植术后人工血管的远期通畅率不足50%，自体大隐静脉的远期通畅率也只有70%左右，术后3～6个月内有20%～40%的患者发生再狭窄[1]。其远期通畅率低的共同原因为发生在吻合口的内膜增生(intimal hyperplasia，IH)导致的再狭窄[2]。解决血管吻合口IH导致的再狭窄，改善移植物远期通畅率一直是血管外科的热门课题。多年来，为数众多的血管外科工作者从不同角度对血管移植术后吻合口内膜增生性再狭窄的病因、发病机制、病理生理及其防治措施进行了广泛探索。现就近年来有关血管吻合口内膜增生性再狭窄的新进展加以综述。

　　1 病因、病理和发病机制

　　自体静脉或人工血管旁路移植、动脉内膜剥脱、血管扩张成形和支架植入对血管造成的机械性损伤均可引起血管内膜增生性再狭窄，导致远端缺血，血管内膜损伤后继发内膜增生性再狭窄的确切机制至今尚未被完全阐明[3]。血管内膜损伤、内皮细胞脱落导致内皮下胶原暴露，激活了凝血过程，从而导致局部凝血酶和纤维蛋白生成、单核细胞、血小板聚集并释放血小板衍化生长因子(platelet derive growth factor，PDGF)等一系列内源性因子。这些内源性因子主要包括原癌基因(cfos，cjun，cmyc)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth fachor，bFGF)等有丝分裂原，白介素、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子。在这些内源性因子的作用下，位于血管中膜的平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)增殖并移行至内膜，再次大量增殖并合成、分泌细胞外基质，从而导致血管内膜增生[3]，其中SMC在中膜增殖后从血管壁的中膜趋化移行至内膜是血管损伤后继发IH的关键步骤[4]。

　　血管内膜(过度)增生(vascular intimal hyperplasia，VIH) 是动脉重建手术后2～24 个月内发生狭窄或者闭塞的主要原因。目前已经证实血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)过度增殖是再狭窄发生的重要病理机制，位于血管中膜的VSMC包括多个亚群，血管损伤的刺激能够诱导某些亚群发生增殖，这些发生增殖的亚群经历了表型转换，表现在细胞中α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、平滑肌肌球蛋白重链及SM22α等收缩成分含量减少[5]。分子生物学认为，增生内膜由20%的VSMC和60%～80%的胞外基质构成，VIH的过程有3个高峰：(1)动脉内膜损伤初期VSMC在中膜增生;(2)VSMC由中膜迁移至内膜;(3)VSMC增殖、游移以及大量胞外基质的合成使内膜迅速增厚。血管吻合可造成内皮细胞(Vascular Endothelium Cell，VEC)脱落，血管中膜损伤。内皮细胞覆盖吻合口内表面是防止内皮细胞下层组织过度增生引起管腔狭窄、继发血栓形成的关键。内皮细胞的功能主要有：(1)产生抗血栓形成的前列环素(PGI2);(2) 有抗凝血功能;(3)调节间质细胞过度生长;(4)抑制VSMC过度生长[6]。VEC损伤促使IH的可能机制为：(1)VEC损伤、脱落后失去了与VSMC形成的正常的异类细胞的连接，解除了对VSMC增殖的抑制(接触抑制);(2)VEC损伤、脱落会使血液和血管壁之间的天然屏障遭到破坏，促使白细胞和血小板在局部血管壁黏附、聚集并分泌细胞因子、生长因子和血管活性物质，从而导致血管壁的VSMC在各种细胞因子、生长因子和血管活性物质的作用下发生增殖、移行和转型;(3)VEC损伤后分泌的肝素样物质减少，局部的一氧化氮浓度减少，而肝素样物质和一氧化氮具有抑制VSMC增值和表型转换的作用。

　　目前研究表明，单核巨噬细胞在血管内膜增生性再狭窄的发病机制中发挥了关键作用[7]。大量研究表明，血管内膜损伤后炎性细胞在损伤局部迅速聚集，炎性反应在血管修复、IH的级联过程中发挥了重要作用[8]。巨噬细胞渗出和血液中单核细胞激活与VIH密切相关，其可能的机制为巨噬细胞表达多种促进VIH的生长因子、细胞因子和蛋白酶[9]，其中IL1和基质金属蛋白酶是活化的巨噬细胞产生的两种促进VIH的重要物质， 耗竭巨噬细胞或降低IL1和基质金属蛋白酶的水平可减轻由此引起的VSMC增殖[10]。耗竭巨噬细胞同样可以减轻静脉移植物的吻合口IH，提示巨噬细胞在各种原因导致的血管内膜损伤中具有普遍的促进VIH的作用[16]。

　　另外，部分学者研究表明，血清脂蛋白胆固醇特别是低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量增高可能是促使IH的重要原因，人工血管移植术后内皮化不够完善时，由于前列环素(PGI2)减少，脂质易于沉积于血管内膜使其增厚[11]。

　　多种生长因子参与血管吻合口内膜增生，主要包括红细胞生成素、血小板生成素、PDGF、bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。其中bFGF在启动和维持这一过程中发挥了关键作用。我国学者对bFGF在VSMC中的表达、其促进IH的作用机制及通过在基因水平阻断bFGF的作用抑制IH进行了深入探索[1]。指出bFGF是VSMC的强有丝分裂原和生存因子[12]，并且bFGF及其受体FGFR1在血管吻合口内膜中的VSMC有高表达。一方面bFGF通过自分泌的方式作用于受体，触发一系列信号级联传导系统，最终将细胞外信号传入核内，导致细胞增值反应;另一方面，内源性bFGF合成后进入核内，通过细胞内分泌方式有效的促进DNA合成和细胞增殖。与bFGF基因互补的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)能够通过封闭bFGF基因，抑制bFGF表达，起到有效抑制血管吻合口IH的作用。但其作用持续时间很短，只能维持5 d左右[1]。局部高浓度的PDGF是引起SMC向内膜迁移的最主要原因，PDGF不仅是最有力的有丝分裂原， 而且具有明显的趋化性， 它可刺激VSMC增生， 并促使中膜SMC向内膜迁移。转化生长因子β1(TGFβ1)可使细胞外基质发生聚集，而VEGF具有特异的促进VEC增殖和强烈的血管通透作用，在VSMC增殖的活跃期二者均有高表达，提示二者可能相互作用，协同参与吻合口HI。Jlll等[13]研究发现在血管内膜损伤后早期，肝细胞瘤源性生长因子(hepatomaderived growth factor，HDGF)在受损血管壁的中膜和新生内膜中即有高表达。HDGF是新近发现的作用于细胞核的一个生长因子家族中的第一个成员，与其它生长因子家族没有同源性，它能够刺激多种细胞发生移行，已经证明它是上调视网膜色素上皮细胞的基因之一并能刺激其发生移行。HDGF是SMC的强有丝分裂原，同时能够刺激SMC由中膜向内膜移行，在SMC中其表达不受PDGF和凝血酶的调节，并据此提出HDGF是治疗血管损伤后HT的潜在靶点。

　　血管损伤后VSMC增生与某些原癌基因表达密切相关，研究表明，早期应答基因Cmyc是血管移植术后VSMC增殖的始动基因之一，它可诱导静止的VSMC进入增殖周期并调控VSMC的增殖。

　　研究表明，凝血酶在机械性血管损伤诱发VIH的发生过程中发挥重要作用，其通过作用于血小板、其他血细胞和血管壁细胞上的凝血酶受体导致分子和细胞间相互作用，从而在血管内膜损伤的部位促进VIH[14]。组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤维蛋白原(FG)和VIH密切相关，血管内皮细胞分泌的tPA能够促进纤溶酶原转化为纤溶酶，进而溶解FG，预防吻合口血栓形成，从而抑制HI。而高浓度的FG可抑制tPA的活性，促进吻合口IH，提示临床上降纤治疗对预防血管吻合口再狭窄有一定作用。总之，血管移植后在内膜、VEC损伤和继发血栓形成等各种因素的作用下，位于血管中膜的SMC在各种细胞因子、趋化物质和有丝分裂原的作用下迁移至内膜并大量增殖，同时发生形态和功能的改变，即表型转换，由正常的收缩型SMC转化为合成型SMC，大量增殖并合成、分泌细胞外基质和多种细胞因子，最终导致血管吻合口内膜增生性再狭窄。由此可见，VIH是一个多因素、多因子共同参与的复杂的过程，其始动和关键因素是内膜、VEC损伤[15]，其主要病理改变和核心环节是VSMC移行、增生和分泌细胞外基质。

　　2 防治措施

　　2.1 药物治疗 血管紧张素转化酶抑制剂和钙离子拮抗剂能够抑制VSMC增殖和迁移，具有一定的抑制VIH的作用[16]。抗凝、抗血小板药物和糖皮质激素也具有一定的预防血管内膜增生性再狭窄的作用，但效果不理想[5]。血管内膜损伤、VEC脱落后可引起内皮下胶原暴露，血小板可粘附聚集于内皮下胶原，并释放PDGF，从而促进VIH。故抗血小板药物具有一定的抑制VIH的作用。降血脂药可在一定程度上抑制VIH，我国学者通过口服辛伐他汀降低血清脂蛋白胆固醇，成功地抑制了犬人工血管移植术后吻合口IH，改善了人工血管通畅率。放线菌素D可通过抑制血管损伤后原癌基因Cmyc应答抑制VIH。Danenberg等[7]通过球囊扩张大白鼠和高胆固醇血症新西兰大白兔的颈总动脉制作出血管内膜增生性再狭窄的动物模型，然后通过静脉注射全身应用含有clodronate的脂质体(LC)以灭活和杀伤单核巨噬细胞有效的预防了血管内膜增生性再狭窄[16]。球囊扩张性损伤前注射LC能够迅速降低血液中的单核细胞和肝、脾及受损动脉壁中的巨噬细胞的数量和活性，降低受损动脉段中IL1和基质金属蛋白酶的水平。阻止单核巨噬细胞从血管内和/或血管外膜进入受损的血管壁可以阻断其引起的VSMC的移行和增殖[16]。Clodronate属于双磷酸盐家族，能够有效的抑制来源于巨噬细胞的破骨细胞，由于游离的Clodronate带负电荷并高度亲水，故很难通过细胞膜[17]。脂质体易被网状内皮系统摄取，尤其是易被巨噬细胞摄取。LC可以被巨噬细胞选择性的有效内吞，内吞后在溶酶体的作用下脂质体的脂质双分子层遭到破坏，游离的clodronate被释放到细胞中，从而引起巨噬细胞不可逆性功能损伤和凋亡。LC对VEC和VSMC等非吞噬细胞无毒副作用。

　　2.2 基因治疗 近年来，VIH的基因治疗日益成为血管外科的热门课题。基因治疗的方法是用载体系统将靶基因导入体内发挥抑制VSMC增殖和促进内皮修复的作用，其疗效主要取决于靶基因、载体系统和基因导入途径的选择。靶基因主要包括各种反义基因和具有细胞毒或细胞静止作用的基因。靶基因载体的选择要求外源基因能够在体内高效、稳定地表达。病毒类载体转染效率较高，特异性强，是目前临床上常用的载体。基因导入的途径有离体法和直接体内法，后者的应用进展较大。已有研究人员通过手术缝线或生物蛋白胶携载基因将靶基因直接导入血管吻合口局部，有效的抑制了吻合口IH[18]。

　　以基因干预VSMC增殖的途径有：(1)反义寡核苷酸，将能与靶基因结合的RNA或DNA片段导入细胞以抑制相应靶基因的复制、转录、剪切、翻译、表达，降低细胞内靶基因表达的蛋白质含量;(2)胸腺嘧啶激酶或TK基因(thymidine kinase)，又称自杀基因，能使某些抗病毒药物如丙氧鸟苷(GCV)磷酸化，阻断细胞DNA链的复制，使细胞凋亡，还能通过“旁观者效应”杀死周边未感染该基因的细胞，起到抑制增殖的目的;(3)视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma， Rb基因)，磷酸化的Rb基因能使转录因子E2F释放，后者与Cmyc、cdc2、PCNA 等基因启动子上特定核苷酸序列结合后通过转移非磷酸化Rb基因，有抑制细胞增殖的作用;(4)p53基因，可引起VSMC凋亡，抑制增殖过程中的DNA和促使p53蛋白表达，并同cyclincdk结合从而阻止DNA的合成和细胞分裂，使G1期停滞，进而对DNA进行修复，未修复者则发生凋亡;(5)一氧化氮合酶基因(NOS基因)，它不仅有扩张血管的作用，还能抑制平滑肌细胞的增殖及移行;(6)hVEGF基因，能转移至血管壁，并在SMC内持续表达至少4周，表达蛋白作用于VEC，加快损伤内皮的再生，可望防止再狭窄的发生。

　　我国学者通过手术缝线携载尿激酶原基因将该基因导入血管吻合口局部，表达出具有生物活性的尿激酶。尿激酶能够选择性地裂解纤维蛋白， 破坏纤维蛋白的稳定性， 从而防止血小板的粘附和激活，同时减少了PDGF的释放，由此成功的抑制了VIH。血管内皮生长因子165(vascular endothelium growth factor，VEGF165)是高效、特异作用于VEC的糖蛋白，能够刺激VEC分裂、增殖，促进损伤的VEC修复和恢复功能。我国学者应用VEGF165和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因联合转染局部血管壁的VEC和VSMC，有效的抑制了VIH，为调控多基因防治血管重建术后吻合口再狭窄奠定了基础[19]。水蛭素能够特异性拮抗血小板、白细胞、VEC和VSMC上的凝血酶受体，从而直接抑制血管中膜VSMC的移行和增殖，抑制血小板和单核巨噬细胞激活、聚集、释放PDGF及PDGF引起的VSMC移行和增殖[20]。Lundell等[21]应用携载水蛭素基因的逆转录病毒转然体外培养的狒狒的VEC，再将已被转染的VEC体外种植到覆有胶原纤维结合素的ePTFE人工血管的腔面，然后将种植了该种VEC的人工血管植入狒狒的肱动静脉之间，转染了水蛭素基因的VEC可在吻合口局部持续释放有效浓度的水蛭素，有效的抑制了人工血管自体静脉吻合口IH。

　　原癌基因Cmyc是一种广泛存在的磷酸化蛋白，在细胞增殖中起着十分关键的作用，它是细胞从G0/G1期进入S期的驱动因子，是决定细胞终末分化还是继续增殖的选择开关[20]。Cmyc等与VIH有关的基因表达相应的细胞因子，这些细胞因子作用于相应的受体，经过复杂的信号传导，最终将信息传入细胞核内，促进VSMC的DNA合成和细胞增殖。反义基因治疗是针对VIH发生的上述机制，在体外人工合成与相应促VIH基因碱基互补的寡核苷酸，并通过适当的载体导入吻合口内。寡核苷酸通过碱基互补与相应靶基因特异性结合，从而封闭了靶基因，达到抑制靶基因表达相应促VIH产物，减轻VIH的目的。应用医用生物蛋白胶和手术缝线作为载体将Cmyc反义寡核苷酸导入实验动物血管吻合口内，观察到与对照组相比，近期内Cmyc表达的mRNA明显减少，血管吻合口的IH程度明显减轻。反义基因治疗主要包括三种类型，一是反义原癌基因，如Cmyc、Cmyb、Cras等。二是反义细胞周期调节基因，主要包括反义cdc2、cdk2和增殖细胞核抗原(PCNA)等，应用PCNA反义技术，可成功的抑制其基因表达，从而抑制VSMC增殖和移行。三是各种反义细胞因子基因。单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)1是目前公认的主要调节单核细胞粘附及迁移进入血管壁的物质，MCP1持续高表达在移植血管早期炎性细胞浸润和新生内膜增殖中起着重要的始动作用。我国学者已通过兔移植静脉段局部定位转染反义MCP1基因成功的抑制了MCP1在移植静脉中的表达，从而有效的抑制了VIH[22]。

　　2.3 光动力疗法 光动力疗法是近年来开展的预防血管吻合口 IH的一种新方法，原理为组织中预存的光敏剂吸收光能后被激发为氧离子，使细胞发生强烈氧化，从而抑制其增生。主要方法有传统的激光体外辐射疗法和血管腔内激光辐射疗法，后者更适合腔内血管外科的发展。在吻合口局部导入光敏剂之后，再用相应波长的单色光源从血管内照射吻合口，可有效抑制吻合口内膜增生[23]。

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